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冻存管中，置于液氮中速冻，然后转移到 -80 ℃超低温 1.4 统计学方法 应用 SPSS 17.0 和 GraphPad 8 统计软
冰箱中保存。（2）使用 DNA 提取试剂盒提取 DNA 后， 件对数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料以（
通过琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 提取质量，同时采用紫 ±s）表示，两组间比较采用独立样本 t 检验，组内比较
外分光光度计对 DNA 进行定量。（3）对细菌 16S rDNA 采用配对 t 检验；多组间比较采用方差分析，组间两两
2
基因 V3~V4 区域进行 PCR 扩增。16S rDNA 基因 V3~V4 比较采用 SNK-q 检验。分类资料的组间比较采用 χ 检
区引物序列正向引物：5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'， 验。以 P<0.05 为差异有统计学意义。
反向引物 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'。PCR 2 结果
反应程序为：首先在 98 ℃条件下预变性 30 s；然后进 2.1 患者治疗前一般资料及临床指标比较 本研究最
行 35 个循环，包括：98 ℃变性 10 s，54 ℃退火 30 s， 终共 93 例患者完成试验，其中常规治疗组 46 例，干预
72 ℃延伸 45 s；最后在 72 ℃条件下延伸 10 min。PCR 治疗组47例。两组患者性别、年龄、BMI及治疗前收缩压、
产物经 2% 琼脂糖凝胶电泳进行证实。在整个 DNA 提 舒张压、血红蛋白、血清白蛋白、Scr、补体 C3 和补体
取过程中，使用超纯水排除假阳性 PCR 结果作为阴性 C4 比较，差异均无统计学意义（P>0.05），见表 1、2。
对照的可能性，PCR 产物由 AMPure XT beads（Beckman 2.2 临床疗效评价 治疗前，两组患者 R-SLEDAI 评
Coulter Genomics，Danvers，MA， 美 国） 纯 化，Qubit 分比较，差异无统计学意义（P>0.05）。治疗 24 周后，
（Invitrogen， 美 国） 定 量。 扩 增 子 池 用 于 测 序， 扩 干预治疗组 SLEDAI 评分低于常规治疗组，差异有统计
增子文库的大小和数量分别在 Agilent 2100 生物分析 学意义（P<0.05），见表 3。
仪（ Agilent， 美 国） 和 Illumina （Kapa Biosciences， 2.3 患者治疗前后肾功能变化情况 治疗前两组患者
Woburn，MA，美国）的文库定量试剂盒上进行评估。 24 h 尿蛋白定量、BUN、Scr 比较，差异无统计学意义
在 NovaSeq PE250 平台上对库进行排序。（4）样品按 （P>0.05）；治疗 4、12、24 周后，两组患者 24 h 尿蛋
照制造商的建议进行测序，由 LC-Bio 提供。根据样品 白定量、BUN、Scr 较治疗前降低，差异有统计学意义
独特的条形码，将配对端序列分配给样品，并将建库引 （P<0.05）；治疗 4、12、24 周后，干预治疗组患者 24
入的 barcode 和引物序列去除。使用 FLASH 合并匹配 h 尿蛋白定量和 BUN 均低于常规治疗组，治疗 24 周后
端读取。根据 fqtrim（v0.94），在特定的过滤条件下对 Scr 低于常规治疗组，差异有统计学意义（P<0.05），
原始数据进行质量过滤，以获得高质量的 clean 标签。 见表 4~6。
使用 Vsearch 软件对嵌合序列进行过滤。利用 DADA2 2.4 患者治疗前后血清 IgE、IgG 水平变化 两组患
（Divisive Amplicon Denoising Algorithm）进行解调，使 者治疗前血清 IgE、IgG 水平比较，差异无统计学意义
用 ASVs（Amplicon Sequence Variants）的概念构建类操 （P>0.05）；治疗 24 周后，两组患者血清 IgE、IgG 水
作分类单位（Operational Taxonomic Units，OTU）表，
表 1 两组患者治疗前一般资料比较
获得最终的 feature 特征表以及特征序列。多样性通过归 Table 1 Comparison of general between lupus nephritis patients treated
一化到相同的随机序列来计算。然后根据 SILVA（release with routine treatment，and routine treatment plus probiotics at baseline
132）分类器，利用每个样本的相对丰度对特征丰度进 组别 例数 性别 年龄 BMI 2 收缩压 舒张压
行归一化。采用 Blast 进行序列比对，每个代表性序列 （男 / 女） （岁） （kg/m ） （mm Hg） （mm Hg）
常规治疗组 46 18/28 33.6±6.6 22.7±2.2 127±11 78±11
用 SILVA 数据库对特征序列进行注释。采用 LEfSe 分析
干预治疗组 47 20/27 34.4±8.8 22.4±2.0 129±8 77±11
肠道菌群丰度。 t（χ ）值 0.113 a 0.457 0.811 1.187 0.400
2
1.3.5 短链脂肪酸检测 采用气相质谱分析法测定健 P 值 0.737 0.649 0.420 0.238 0.690
康志愿者、LN 患者、常规治疗组治疗 24 周后和干预 注：BMI= 体质指数，1 mm Hg=0.133 kPa； 表示 χ 值
2
a
治疗组治疗 24 周后粪便中短链脂肪酸（甲酸、乙酸、
丙酸、丁酸）含量。（1）将新鲜粪便使用蒸馏水以 表 2 两组患者治疗前临床指标比较（ ±s）
Table 2 Comparison of clinica indices between lupus nephritis patients
1∶9 进行均值稀释，混匀，于 -80 ℃保存备用。（2） treated with routine treatment，and routine treatment plus probiotics at
使用固相动态微萃取技术将混合物分离，将所得上清 baseline
液使用气相质谱分析，条件为：色谱柱 VF-WAXms， 组别 例数 血红蛋白 血清白蛋白 Scr 补体 C3 补体 C4
0.25 mm×30.00 m，0.25 μm， 初 始 温 度 70 ℃， 保 （mmol/L） （g/L） （μmol/L） （g/L） （g/L）
常规治疗组 46 76.0±13.3 26.68±6.38 61.99±12.07 0.55±0.20 0.11±0.03
持 1 min，按 10 ℃ /min 升温速率升温至 200 ℃，保持
干预治疗组 47 75.6±12.6 25.96±6.05 62.03±12.96 0.56±0.15 0.12±0.02
2 min，30 ℃ /min 升温速率升温至 240 ℃，保持 2 min， t 值 0.049 0.559 0.015 0.273 1.895
进样口温度为 250 ℃。（3）将所得产物进行质谱分析， P 值 0.961 0.578 0.988 0.785 0.061
测量样本中甲酸、乙酸、丙酸、丁酸含量。 注：Scr= 血肌酐