Page 87 - 2022-26-中国全科医学
P. 87

·3284· http://www.chinagp.net   E-mail:zgqkyx@chinagp.net.cn


           1.5 实验分组及给药 未注射 STZ（注射同等剂量枸                         低温冰箱保存。实验时将创面组织于 -80 ℃取出，冰上
           橼酸 - 枸橼酸钠缓冲液）的血糖正常的 10 只小鼠作为                        解冻并称重，剪碎后放于 EP 管中，按照每 20 mg 组织
           正常对照组（normal control，NC 组）。糖尿病模型建                   加入 100 μl 裂解液（含 1% PMSF）的比例加入 RIPA
           造成功的小鼠按照随机数字表法分为 6 组：糖尿病模型                          裂解液。功率 400 W，冰水浴超声 5 s，间隔 30 s，次
           组（diabetic model，DM 组）、重组人表皮生长因子阳                   数 4 次。充分匀浆后，4 ℃，12 000 r/min 离心 10 min，
           性 对 照 组（recombinant human epidermal growth factor，  离心半径 8.6 cm。吸取上清液，BCA 法测定蛋白浓度。
           rhEGF 组）、空白基质阴性对照组（matrix 组）、低剂                     聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，并将其转移到聚偏二氟
           量 o-HA 治疗组（0.5% o-HA 组）、中剂量 o-HA 治疗                 乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，脱脂奶粉
           组（1% o-HA 组）、高剂量 o-HA 治疗组（2% o-HA 组），               中封闭 1 h，TBST 缓冲液（TBS with Tween-20，TBST）
           每组 10 只。NC 组和 DM 组小鼠创面不做任何处理，其                      清洗 3 次，加入一抗（Nrf2 按 1∶2 000 稀释，HO-1、
           他各组每日创面及创周常规消毒后，均匀涂抹 o-HA 软                         NQO1、β-actin 按 1∶1 000 稀释），4  ℃孵育过夜，
           膏于创面及创周，rhEGF 组给药 1 次 /d，0.5%、1%、2%                 TBST 清洗 3 次。随后，加入 1：20 000 稀释的山羊抗
           o-HA 组给药 2 次 /d，连续给药 14 d。                          兔或山羊抗鼠二抗，在室温下孵育 1 h，TBST 清洗 3 次，
           1.6 指标测定                                            增强型化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）
           1.6.1 创面愈合分析 第 1、7、14 天用相机对创面闭                      试剂进行显色。Image J 软件对条带进行定量分析，以
           合区域进行追踪，用 Image J 对创面愈合面积进行量化，                      目的蛋白灰度值 / 内参蛋白灰度值的比值作为该蛋白的
           得到创面愈合率，公式为：创面愈合率（%）=（原始                            相对表达量，对结果进行归一化后进行统计分析。
           创面面积 - 未愈合创面面积）/ 原始创面面积 ×100%。                      1.7 统计学方法 采用 GraphPad prism 8.4.2.679 软件进
           1.6.2 创面组织苏木素 - 伊红（Hematoxylin and eosin，           行统计分析，计量资料以（ ±s）表示，两组间比较采
           HE）染色、马松三色（Masson trichrome，Masson）染                用独立样本 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，
           色和 CD34 免疫组化染色观察 连续给药 14 d 后，取小                     组间两两比较采用 SNK-q 检验。以 P<0.05 为差异有统
           鼠创面及创周皮肤组织，置于 4% 多聚甲醛中固定，石                          计学意义。
           蜡包埋进行 HE 染色、Masson 染色和免疫组化染色，于                      2 结果
           光镜下进行观察。通过 HE 染色观察创面肉芽组织形态                          2.1 糖尿病小鼠造模情况 第 0 周时，正常对照小鼠
           学变化，通过 Masson 染色观察创面组织真皮层胶原纤                        和糖尿病模型小鼠体质量、FBG 比较，差异均无统计学
           维沉积情况，通过 CD34 免疫组化染色观察 o-HA 对创                      意义（P>0.05）；第 2、4、6、8 周时，糖尿病模型小
           面新生血管的影响。CD34 多用于标记血管内皮细胞，                          鼠体质量低于正常对照小鼠，FBG 高于正常对照小鼠，
           血管腔内一层连续或不连续的阳性着色带，即为染色的                            差异均有统计学意义（P<0.05），见表 1、2。每周检测
           内皮细胞。利用 CD34 免疫组化染色对小鼠创面新生血                         糖尿病模型小鼠 FBG 均 >16.7 mmol/L，且体质量增长缓
           管密度进行评估，采用 Image-Pro Plus 6.0 软件计算免                 慢，出现多饮、多食、多尿、毛发暗黄的表现，认定糖
           疫组化切片照片的阳性细胞数，除以细胞总数，即为每                            尿病模型构建成功。体内实验时间线见图 2。
           张免疫组化切片的阳性细胞率。                                      2.2 o-HA 对 DCU 小鼠创面愈合的影响 给药第 7、14
           1.6.3 血清 MDA、SOD 水平分析 末次给药后各组小                      天，各组小鼠创面愈合率比较，差异均有统计学意义
           鼠分别摘眼球取全血，室温静置 1 h，4 ℃，3 000 r/min                  （P<0.05）；其中给药第 7 天，DM 组、matrix 组创面
           离心 10 min，离心半径 8.6 cm，取上层血清，使用相应                    愈合率低于 NC 组，rhEGF 组、1% o-HA 组创面愈合率
           的试剂盒检测血清 SOD、MDA 水平。                                高于 DM 组，0.5% o-HA 组、2% o-HA 组创面愈合率低
           1.6.4 Western-blotting 法检测创面组织 Nrf2、HO-1、           于 NC 组、高于 DM 组；给药第 14 天，DM 组、matrix
           NQO1 蛋白表达 连续给药 14 d 后，取小鼠创面及创周                      组创面愈合率低于 NC 组，rhEGF 组、0.5% o-HA 组、1%
           皮肤组织，置于 1.5 ml 冻存管中，液氮速冻后 -80 ℃深                    o-HA 组、2% o-HA 组创面愈合率高于 DM 组，差异均

                                           表 1 两组小鼠不同时间点体质量比较（ ±s，g）
                                   Table 1 Comparison of weight level between two groups of mice at different time
                    组别            只数        第0周           第2周            第4周           第6周           第8周
                 正常对照小鼠            10     25.06±0.58     35.07±0.63    42.58±0.53    46.84±1.10     48.96±0.78
                糖尿病模型小鼠            60     26.63±0.51     25.72±0.83    25.67±0.58    25.57±0.80     24.82±0.90
                    t 值                      2.04          8.96          21.54          15.59         20.29
                    P 值                      >0.05         <0.01         <0.01          <0.01         <0.01
   82   83   84   85   86   87   88   89   90   91   92