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·296·  http: //www.chinagp.net   E-mail: zgqkyx@chinagp.net.cn                     Jaunary  2023, Vol.26  No.3

           气管内，使用缝合线固定，取 5 ml 注射器去除针头，                         质量之比。将各组大鼠肺泡巨噬细胞使用胰蛋白酶消
           吸取含体积分数 5% 青霉素 - 链霉素 - 两性霉素 B 混合                    化后，收集于 15 ml 离心管中离心（2 000 r/min，离心
           溶液的冷 PBS 缓冲液 3 ml，由气管插管口注入大鼠肺                       10 min，离心半径为 6 cm），吸去上清，后各加入 3 ml
           内，轻柔按摩 2 min 后回吸，重复 5 次，可回收 BALF                    RPMI 1640 培养液重悬，使用细胞计数板在显微镜下计
           约 10 ml，离心（4 000 r/min，离心 20 min，离心半径为              算每只大鼠的肺泡巨噬细胞数量。
           9 cm）后取上清液于 -80 ℃冰箱保存，沉淀应用红细胞                       1.2.9 大鼠肺泡巨噬细胞的透射电镜观察 采用透射电
           裂解液去除红细胞，用无血清 RPMI 1640 培养液重悬计                      镜观察大鼠肺泡巨噬细胞的超微结构，将大鼠的左肺组
           数，接种入细胞培养瓶中，置于细胞培养箱中培养 3 h                          织取出后切成小块，快速放入新鲜的 2.5% 戊二醛固定
           后换液，用传统贴壁法进一步提纯细胞。                                  液中，在固定液中使用锋利的刀片将肺组织切成 1 mm                     3
           1.2.5 HE 染色 采用 4% 多聚甲醛固定大鼠右肺组织                      大小，乙醇、丙酮脱水后丙酮、环氧树脂浸透，再进行
           48 h 后，采用梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，                         包埋、聚合，超薄切片（厚度 60 nm）。先后使用醋酸
           冰冻后切片，切片厚度为 3 µm，二甲苯脱蜡脱水，进                          铀避光染色、枸橼酸铅避光染色，使用透射电镜观察巨
           行 HE 染色后使用中性树胶封固。使用倒置显微镜拍照，                         噬细胞内结构并采集图像。
           采用 Image-Pro Plus 6.0 图像分析软件进行分析测算。                 1.2.10 大鼠肺泡巨噬细胞中自噬相关蛋白表达水平测
               肺泡病理改变：在每只大鼠的 HE 染色切片中选取                        定及微管相关蛋白轻链 3（LC3）- Ⅱ /LC3- Ⅰ比值计
           5 个不同视野，200 倍镜下观察、记录、分析肺泡的病                         算 采用免疫印记法检测 PI3Kp110α、Akt、p-Ak、
           理改变。如下，（1）观察肺平均内衬间隔（MLI）：                           mTOR、p-mTOR、LC3- Ⅱ、LC3- Ⅰ表达水平，将各
           以每个视野的正中为中心划“十”字线，计数经此十字                            组大鼠原代肺泡巨噬细胞从培养箱中取出，吸去培养
                                                                                                        6
           线的肺泡间隔总数（Ns），计算十字线总长度（L），                           液，使用 PBS 缓冲液清洗 2 遍后按照每 1×10 个细胞
           MLI=L/Ns，其值反映肺泡平均直径；（2）平均肺泡数                        加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解液 200 µl，4 ℃
           （MAN）：计数每个视野内的肺泡总数（Na），除以                           充分裂解细胞，提取肺泡巨噬细胞总蛋白，用 BCA 试
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           此视野的面积（TA），MAN=Na/TA（个 /mm ），其值                     剂盒检测蛋白浓度，调整蛋白浓度使各组保持一致，
           反映肺泡的密度；（3）平均肺泡面积（MAA）：以 HE                         取 20 µg 总蛋白进行上样，用 SDS-PAGE 电泳分离
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           染色阳性区域的面积为 PA，MAA=（TA-PA）/Na（µm ）。                  后，湿法转膜，5% 脱脂奶粉室温封闭 2 h，然后加入一
           气道重塑：显微镜下观察各组大鼠支气管的结构、形态、                           抗 PI3 Kinase p110α、Akt、p-Ak、mTOR、p-mTOR、
           纤毛排列以及炎性细胞浸润情况。                                     LC3A/B、β-Actin，稀释比均为 1∶1 000，4 ℃过夜，
           1.2.6 ELISA 检测 采用 ELISA 检测大鼠 BALF 与血清               PBST 缓冲液洗涤 3 次，按照 1∶10 000 稀释辣根过氧
           中 IL-6、IL-8 水平，具体操作按照试剂盒说明书进行。                      化物酶（HRP）标记的羊抗兔 IgG 二抗，与膜室温孵育
           1.2.7 原代肺泡巨噬细胞的免疫荧光鉴定 CD68 抗体                       1 h，用 PBST 缓冲液洗涤 3 次，将膜放置在暗室中，根
           分布在细胞表面，在单核细胞的表面表达较少，当其                             据用量取 ECL 发光液进行显影，采用 Image J 图像分析
           向巨噬细胞转化后表达明显增加，CD68 抗体是巨噬细                          软件统计各条带灰度值并计算各蛋白表达水平及 LC3-
           胞谱系中高度特异性表达的蛋白质，常作为鉴定巨噬                             Ⅱ /LC3- Ⅰ比值。
           细胞的特异性标志物         ［15-16］ ，纯化后的巨噬细胞使用胰              1.3 统计学处理 采用 SPSS 17.0 统计软件进行数据分
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           蛋白酶消化后，重悬调整细胞浓度为 2×10 个 /ml，将                       析，计量资料以（x±s）表示，数据符合正态分布并方
           24 孔板爬片置入 24 孔板中，巨噬细胞接种于细胞爬片                        差齐，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较
           上，放入细胞培养箱中培养 4 h 后取出，巨噬细胞已完                         采用 LSD-t 检验。以 P<0.05 为差异有统计学意义。
           全贴壁。先后予 PBS 缓冲液浸洗、4% 多聚甲醛固定、                        2 结果
           0.5%Triton X-100 室温通透、5% 山羊血清 37 ℃封闭、               2.1 六组大鼠肺泡病理改变 HE 染色结果显示：正常
           CD68 抗体 4 ℃孵育过夜、荧光羊抗兔二抗 37 ℃孵育、                     对照组大鼠肺泡结构正常连续，肺泡壁完整，泡腔无扩
           DAPI 染核、抗荧光淬灭剂封固，使用倒置荧光显微镜                          大，肺泡数目较多；与正常对照组相比，COPD 模型组
           观察、拍照。                                              大鼠肺泡结构杂乱，肺泡壁变薄断裂，肺泡腔扩大，肺
           1.2.8 各组大鼠肺泡巨噬细胞数量的比较 由于各组大                         泡间隔数量明显减少，出现较多肺大泡，肺气肿明显；
           鼠间体质量存在一定差异，因此采用单位质量肺组织肺                            GBE 组及各抑制剂组大鼠肺泡损伤程度较 COPD 模型组
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           泡巨噬细胞的收集量（×10 /g 肺组织）来比较各组大                         有所减轻，肺泡结构基本正常，肺大泡形成较少，见图 1。
           鼠肺泡巨噬细胞数量差异，具体计算方法如下：大鼠                             六组大鼠 MLI、MAA、MAN 比较，差异有统计学意义
           肺泡灌洗收集到的肺泡巨噬细胞总数量与大鼠肺组织的                            （P<0.05）。COPD 模型组、GBE 组、比卡鲁胺组、雷
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