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2023年1月   第26卷   第3期                                 http: //www.chinagp.net   E-mail: zgqkyx@chinagp.net.cn  ·295·

           由基、抗氧化等主要药理作用             ［10］ ，临床上被广泛应用            1.2 实验方法
           于治疗心脑血管疾病。近年来有关 GBE 治疗 COPD 的                       1.2.1 COPD大鼠造模与结果判定 正常对照组于第1、
           报道日益增多。梁炜等          ［11］ 研究发现 GBE 可抑制 COPD          14 天向气管内注入 0.9% 氯化钠溶液（NS）100 µl/100 g，
           大鼠气道和全身炎性反应，且早期干预效果更好。谭玉                            其余时间均进行正常饲养。其余各组采用香烟烟雾熏吸
           萍等  ［12］ 发现 GBE 能在一定程度上改善 COPD 大鼠气道                 联合气管内注入 LPS 构建 COPD 大鼠模型            ［13］ ，在造模
           重塑及肺血管重塑情况，但 GBE 治疗 COPD 的具体作                       的第 1 、14 天将大鼠以 10% 水合氯醛（3 ml/kg）以腹
           用机制尚不清楚。本研究旨在验证 GBE 能否通过调控                          腔注射麻醉后，将大鼠固定，暴露喉头，向大鼠气管
           PI3K/Akt/mTOR 信号通路促进肺泡巨噬细胞自噬，起到                     内注入 LPS 100 µl/100 g（1 mg/ml），完毕后将大鼠直
           防治 COPD 的作用，为 GBE 在 COPD 防治中的应用提                    立旋转 10~20 s，使 LPS 均匀分布于肺部，于实验的第
           供实验依据。                                              2~13 天、15~28 天，每天在自制烟熏箱（120 cm×80 cm
           1 材料与方法                                             ×80 cm，含 1 个进烟孔，2 个排烟孔）中对大鼠进行
           1.1 实验材料                                            香烟烟雾暴露，持续吸入新鲜的香烟烟雾 1 h/d，30 支
           1.1.1 研究时间 本实验的研究时间为 2020 年 11 月至                   /d，造模 28 d 结束；造模过程中，因麻醉意外和香烟烟
           2022 年 3 月。                                         雾熏吸导致正常对照组、GBE 组、比卡鲁胺组、雷帕霉
           1.1.2 实验动物与分组 7 周龄 SPF 级雄性 Wistar 大鼠                素组各死亡1只，COPD模型组和Taselisib组各死亡2只，
           90 只，体质量（200±20）g，由长沙市天勤生物技术                        造模结束后，每组大鼠随机处死 2 只进行肺组织病理检
           有限公司提供，许可证号：SCXK（湘）2019-0013。实                      测，判断造模结果。实验 28 d 后，正常对照组大鼠进食、
           验前 1 周将大鼠置于实验环境中饲养，室温 25~28 ℃，                      活动均正常，呼吸顺畅，大鼠肺泡壁完整、泡腔无扩大，
           空气流通好，颗粒麦麸饲养。饲养笼具、饲料、饮水、                            支气管结构正常、形态清晰、纤毛排列整齐，血管腔无
           垫料均按照 SPF 级实验动物的要求进行制备与消毒。按                         狭窄、血管壁无增厚，其余各造模组大鼠出现进食减少、
           照随机数字表法将大鼠随机分为正常对照组、COPD 模                          蜷伏少动、毛发枯黄易脱落、气道有痰鸣音表现，肺组
           型组、GBE 组、比卡鲁胺组、雷帕霉素组、Taselisib 组，                   织病理表现为肺泡壁断裂融合形成肺大泡、肺气肿明显、
           每组 15 只。本实验由广西中医药大学实验动物福利伦                          气道管壁增厚、气道管腔狭窄、血管壁增厚、血管腔狭
           理委员会批准（批准编号：DW20220615-063）。                        窄、炎性细胞浸润明显，判定造模成功。
           1.1.3 实验试剂与仪器设备 银杏叶提取物选用舒血宁                         1.2.2 用药方案 实验的第 15 ~28 天，GBE 组给予舒
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           注射液（国药准字 Z13020795，河北神威药业集团有限                       血宁注射液腹腔注射，用药量为 0.4 ml·kg ·d ，其
           公司），规格 5 ml/ 支，含银杏叶提取物 17.5 mg，总黄                   余各组均腹腔注射同等体积的 NS 做对照；于实验第
           酮醇苷 4.2 mg，银杏内酯 0.70 mg。比卡鲁胺（爱必信                    29~42 天，采用由 DMSO、聚乙二醇、吐温 80、NS 配
           生物科技有限公司，货号：ABS817935），雷帕霉素（大                       制的混合溶剂溶解药剂，比卡鲁胺组按照 1.0 mg·kg                   -1
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           连美仑生物技术有限公司，货号：MB1197），Taselisib（美                  ·d 腹腔注射给药、雷帕霉素组按照 0.5 mg·kg ·d                 -1
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           国 MCE 公司，货号：HY-13898），云烟过滤嘴香烟                       给药、Taselisib 组按照 1.5 mg·kg ·d 给药，其余各
           （红云红河烟草有限责任公司，焦油量 10 mg/ 支、烟                        组均采用腹腔注射混合溶剂对照。
           气烟碱量 1.1 mg/ 支，烟气一氧化碳含量 12 mg/ 支），                  1.2.3 标本采集 全部实验结束后即第 43  天，各组
           脂多糖（LPS）（美国 Sigma 公司，货号：L2880），白                    大鼠用 10% 水合氯醛（3 ml/kg）麻醉，腹主动脉采血
           介素 6（IL-6）和白介素 8（IL-8）酶联免疫吸附检测                      5 ml/ 只，3 000 r/min（离心半径为 9 cm）离心 15 min，
           （ELISA）试剂盒（深圳市欣博盛生物科技有限公司），                         留取血清分装，于 -80 ℃冰箱保存。提取大鼠原代肺泡
           PI3Kp110α（货号：4249）、Akt（货号：4691）、p-Akt               巨噬细胞、留取大鼠肺泡灌洗液（BALF），随后剖取肺脏，
          （货号：4060）、mTOR（货号：2983）、p-mTOR（货号：                   取距离肺门 3 mm 处的右肺组织做连续切片，快速放入
           5536）、LC3A/B（货号：12741）均购自美国 CST 公司，                 4% 多聚甲醛溶液中，用于后续的病理检测。其余的右
           CD68 抗体（北京博奥森生物技术有限公司，货号：bs-                        肺组织经干冰速冻后转移至 -80 ℃冰箱保存，用于后续
           0649R）。倒置显微镜（MI52-N，广东明美），超低温                       的蛋白与 RNA 提取。取左肺组织放入电镜固定液固定，
           冰箱（705，美国 THERMO），倒置荧光显微镜（DMIL                      用于透射电镜观察。
           LED，德国 LEICA 公司），酶联免疫检测仪（DG5033A，                   1.2.4 大鼠原代肺泡巨噬细胞分离纯化与 BALF 留取
           南京华东），冰冻切片机（CM1850 德国 LAICA），全                      参照禹茜等     ［14］ 的方法，将麻醉后的大鼠用 75% 乙醇
           自动化学发光分析仪（Tanon-5200，上海天能），透射                       浸泡 30 min，剪开颈部皮肤，分离气管，在环状软骨下
           电镜（HT7700，日立）。                                      用剪刀做 T 字形切口，将自制气管插管由切口处插入
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