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                                                               的 DOX，共注射 6 周，累计剂量 15 mg/kg；另外两组
            本研究价值：
                                                               大鼠每周通过尾静脉注射等量的 0.9% 氯化钠溶液。
                （1）沉默调节蛋白 3（SIRT3）是线粒体相关的
                                                               DOX+YWPC 组及 YWPC 组大鼠每日中午 12 时通过灌胃
            重要蛋白，本研究通过 SIRT3 作为连接，提供了研
                                                               给予 30 mg/kg（总体积 2 ml）的 YWPC，另外两组给予
            究阿霉素（DOX）与心肌细胞线粒体的桥梁，并且进
                                                               等量 0.9% 氯化钠溶液，每次灌胃后观察 30 min。实验
            一步强调了线粒体功能在心肌细胞中的重要作用；
                                                               大鼠均在 6 周后结束实验。
            （2）黄酒多酚（YWPC）对缓解 DOX 所致心肌损伤
                                                               1.3.2 血清乳酸脱氢酶（LDH）水平检测 动物 LDH
            的过程仍有不明晰的内容，本研究提出了 YWPC 缓
                                                               检测试剂盒购自南京建成生物公司，于动物实验药物干
            解 DOX 引起心肌损伤的新的可能途径。
                                                               预结束后、大鼠心脏摘除前使用采血针刺入大鼠左心
            本研究局限性：
                                                               室取血，分离大鼠血清并用于 LDH 水平的检测，按照
                （1）未能通过相关的实验增加 SIRT3 表达水平，
                                                               试剂盒说明书将各项检测液混合后，使用酶标仪测定
            进一步证明 SIRT3 后续作用；（2）没有深入探究线
                                                               450 nm 处吸光度值。
            粒体功能改变对 YWPC 的影响。
                                                               1.3.3 心脏组织的获取及保存 动物实验药物干预结束
           粒体的代谢功能等进行调节，减少心脏损伤过程中活性                            后，将大鼠心脏取出并横向切分，其中上半部分心脏组
           氧的生成，在与心肌损伤相关的许多通路中发挥着重                             织置于液氮中保存待 Western Blot 法检测使用，下半部
           要作用   ［7］ 。由于多酚类化合物表现出较好的线粒体保                       分用于组织切片的制备，浸泡于 4% 甲醛溶液中固定，
           护作用   ［8-9］ ，因此推测 YWPC 可以通过调节 SIRT3 表               经过常规脱水、浸蜡、包埋后制成切片。
           达水平降低心肌细胞凋亡水平，进而降低 DOX 的心脏                          1.3.4 MASSON 染色和免疫组织化学染色 MASSON
           毒性。为进一步探究 YWPC 在 DOX 心肌损伤中的作用                       染色时取各组大鼠心肌新切片脱蜡处理至水，按照
           机制，本研究拟通过体内及体外实验模拟 DOX 心肌损                          MASSON 染色试剂盒说明书染色后封片，显微镜下观
           伤，并由此观察 SIRT3 在其中发挥的作用，为后期研究                        察各组大鼠心肌切片的心肌纤维形态 / 结构、蓝色胶原
           SIRT3 在 DOX 心肌损伤中的作用及线粒体的功能打下                       纤维显色水平；免疫组织化学染色时将各组大鼠心肌新
           基础，为治疗 DOX 心肌病提供新的思路。                               切片脱蜡处理至水，按照一般流程进行抗原修复，滴加
           1 材料和方法                                             抗 SIRT3 抗体（抗体浓度为 1∶200）后 4 ℃过夜，磷
           1.1 动物及细胞株 体内实验采用 SPF 级雄性 SD 大鼠                     酸盐缓冲液（PBS）清洗后滴加二抗孵育，按照二氨基
           24 只，6~8 周龄，体质量（250±20）g，由上海斯莱克                     联苯胺（DAB）显色试剂盒的使用方法进行显色反应。
           实验动物有限公司提供〔许可证号：SCXK（沪）2017-                        显色终止后使用苏木素染色液将核染为蓝色，染色结束
           0005〕。体外实验采用的大鼠心肌细胞 H9C2 购自中国                       后脱水、封片，观察所显棕黄色的面积与颜色深浅，即
           科学院上海细胞库。本研究通过绍兴市人民医院实验动                            SIRT3 表达水平。
           物伦理委员会审批（伦理批号：2020-012）。                            1.3.5 TUNEL 细胞凋亡检测 将各组大鼠心肌新切片
           1.2 研究试剂 DOX（货号：HY-15142）、SIRT3 抑                   脱蜡处理至水，用蛋白酶 K 37  ℃孵育 30 min，滴加
           制 剂（3-TYP）（ 货 号：HY-108331） 购 自 MCE 公                TUNEL 反应液并 37 ℃避光孵育 1 h，用 PBS 冲洗后使
           司；YWPC 由上海中药制药技术有限公司分离提取，纯                          用二氨基苯基吲哚（DAPI）进行核染，在荧光显微镜
           度 >60%；胎牛血清（FBS）（货号：10270-106）购自                    下观察细胞，其中绿色亮点代表细胞凋亡。
           Gibco 公司；抗 SIRT3 抗体（货号：ab86671）、抗 B 淋               1.3.6 组织总蛋白提取及 Western Blot 法检测 取保存
           巴细胞瘤 -2 蛋白（Bcl-2）抗体（货号：ab32124）及                    在液氮中的新鲜、适量、等质量的各组大鼠心肌组织，
           抗 Bcl-2 相关 X 蛋白（Bax）抗体（货号：ab32503）均                 使用电动匀浆器冰上匀浆裂解，提取组织总蛋白。使
           购自 Abcam 公司；抗甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶（GAPDH）                   用喹啉甲酸（BCA）法进行蛋白定量，根据结果加入
           抗体及二抗购自 Cell Signaling Technology 公司；原位末            适量上样缓冲液，稀释配平后制成蛋白质样品以用于
           端标记（TUNEL）凋亡检测试剂盒购自 Roche 公司；其                      Western Blot法检测。为测定凋亡水平（Bcl-2及Bax蛋白）
           他生化试剂均为进口分装或达到国产分析纯（AR）级别。                          和 SIRT3 表达水平的改变情况，分别使用抗 Bcl-2、
           1.3 研究方法                                            Bax、SIRT3 和内参 GAPDH 抗体 4 ℃孵育过夜，二抗室
           1.3.1 大鼠 DOX 心肌损伤模型的构建及实验分组                         温孵育 1 h。使用化学发光成像系统采集图像，图像处
           动物适用性喂养 1 周后，将大鼠随机分成 4 组：对照                         理分析软件（Image J）对各组大鼠心肌 Bcl-2、Bax、
           组、YWPC 组、DOX 组 与 DOX+YWPC 组。DOX 组 及                 SIRT3 及 GAPDH 条带灰度值进行定量分析。
           DOX+YWPC 组大鼠每周通过尾静脉注射 1 次 2.5 mg/kg                 1.3.7 体外大鼠 H9C2 细胞培养及分组 H9C2 细胞在
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