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                                                               以 3 000 r/min 离心 5 min，离心半径 12 cm，留取上清液，
            本研究行业贡献：
                                                               应用全自动生化分析仪检测血清 TG、TC、LDL-C、
                目前的肥胖控制手段仍然有限，缺乏治疗肥胖和
                                                               HDL-C 水平；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血
            相关代谢性疾病的有效药物。白色脂肪主要用于储存
                                                               清 FFA 水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。
            热量，棕色脂肪主要负责产热。探究白色脂肪向棕色
                                                               1.6 白色及棕色脂肪质量测定 以上实验完成后将小
            脂肪转化的调控机制以及对外部刺激的感应机制，有
                                                               鼠断椎处死，迅速解剖取出小鼠白色脂肪组织（腹股沟、
            助于开发治疗肥胖的新药物。既往研究表明，肌肉生
                                                               附睾、肠系膜）、棕色脂肪组织（肩胛），吸取表面血
            长抑制素（Mstn）可能调控脂肪代谢。本研究在 Mstn
                                                               液及体液，用电子秤称湿重。计算白棕比 = 白色脂肪质
            基因敲除基础上构建 2 型糖尿病（T2DM）小鼠模型，
                                                               量（g）/ 棕色脂肪质量（g），脂肪指数 =（白色脂肪
            探究 Mstn 对 T2DM 小鼠白色脂肪棕色化的影响，发
                                                               质量 + 棕色脂肪质量）（g）/ 体质量（g）。将腹股沟
            现抑制 Mstn 基因表达可上调白色脂肪棕色化相关基
                                                               白色脂肪组织及肩胛棕色脂肪组织一半保存于液氮中，
            因表达，促进 T2DM 白色脂肪棕色化，改善肥胖，为
                                                               一半保存于体积分数 4% 的中性甲醛溶液中，石蜡包埋
            肥胖、T2DM 等代谢性疾病的治疗提供了新策略及新
                                                               固定。
            靶点。
                                                               1.7 白色及棕色脂肪组织形态分析 采用苏木精 - 伊
           床、电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；链脲佐菌                            红（HE）染色法观察脂肪组织形态。包埋好的白色及
           素（STZ，美国 Sigma 公司）；游离脂肪酸（FFA）酶                      棕色脂肪组织标本切成 4 μm 厚薄片，二甲苯及酒精脱
           联免疫试剂盒、兔抗小鼠过氧化物酶体增殖物激活受体                            蜡，水洗；苏木精染液染色 5 min，盐酸水溶液分化，
           γ（PPAR-γ）、过氧化物酶体增殖物激活受体 γ 辅                         氨水水溶液返蓝，水洗；伊红染液染色 3 min，经梯度
           激活因子 1α（PGC-1α）、解偶联蛋白 1（UCP1）多                      酒精及二甲苯脱水透明，中性树胶封固。脂肪组织切片
           克隆抗体（武汉云克隆科技股份有限公司）；兔抗小鼠                            均于光学显微镜下采集图像，采用 Image J 软件分析脂
           分化簇 137（CD137）多克隆抗体（北京博奥森生物技                        肪组织形态。
           术有限公司）。                                             1.8  白 色 及 棕 色 脂 肪 PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、
           1.3 分组及动物模型构建 将 12 只 WT 小鼠、12 只                     CD137 蛋白相对表达量检测 采用 Western-blotting 法
           Mstn（+/-）小鼠、12 只 Mstn（-/-）小鼠随机各分为 2 组，              检测蛋白表达水平。取脂肪组织 50 mg 置于匀浆器，加
           每组 6 只，分别为 WT 组、WT+DM 组，Mstn（+/-）组、                 入蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂，反复多
           Mstn（+/-）+DM 组，Mstn（-/-）组、Mstn（-/-）+DM              次匀浆及冰浴以确保完全裂解。将匀浆液转移至离心管
           组，每组 6 只，其中 WT 组、Mstn（+/-）组、Mstn（-/-）               中，以 12 000 r/min 离心 10 min（离心半径 12 cm）后留
           组给予普通饮食 6 周，WT+DM 组、Mstn（+/-）+DM 组、                 取上清液。BCA 法配制标准蛋白和待测蛋白，37 ℃孵
           Mstn（-/-）+DM 组给予高脂饮食 6 周 +STZ 诱导构建                  育 30 min，用酶标仪测蛋白浓度，制作标准曲线。装好
           T2DM 模型。WT+DM 组、Mstn（+/-）+DM 组、Mstn（-/-）            洁净干燥的玻璃板，根据蛋白大小配制分离胶和浓缩胶，
           +DM 组给予高脂饮食喂养 6 周后，在不禁食状态下以                         分离胶灌至 2/3 处，40 min 后灌入浓缩胶至顶，然后将
           50 mg/kg 腹腔注射 2% STZ（柠檬酸钠缓冲液配制），                    梳子插入浓缩胶中，尽量避免气泡产生。静置 10 min
           72 h 后禁食 6 h，取尾静脉血，血糖仪检测空腹血糖                        后加入电泳液，将样品缓慢加入电泳孔中，电压 60 V，
           ≥ 16.7 mmol/L，并出现多饮、多食、多尿、消瘦症状，                     电泳至溴酚蓝到达底部时停止电泳。加入含有甲醇的转
           即可认为 T2DM 模型构建成功。WT 组、Mstn（+/-）组、                   移缓冲液，电压 60 V 转膜 2 h，将蛋白转移至聚偏氟乙
           Mstn（-/-）组小鼠腹腔注射等剂量柠檬酸缓冲液。普                         烯（PVDF）膜。TBST 缓冲液洗膜 3 次，10 min/ 次。
           通饮食：总热量为 13.5 kJ/g，糖类、脂肪、蛋白质分别                      质量分数 5% 脱脂奶粉封闭 PVDF 膜 1 h。加入 TBST 缓
           占 66%、10%、24%；高脂饮食：总热量为 18.7 kJ/g，                  冲液稀释一抗，4 ℃孵育过夜，TBST 缓冲液洗膜 3 次，
           糖类、脂肪、蛋白质分别占 28%、56%、16%。                           10 min/ 次。加入 TBST 缓冲液稀释二抗，室温下孵育 1 h，
           1.4 体质量、体长测定 建模前及建模成功后，用电                           TBST 缓冲液洗膜 3 次，10 min/ 次。等体积 ECLA 液、
           子秤测定各组小鼠体质量，卷尺测定小鼠体长（鼻尖                             ECLB 液混匀，加至 PVDF 膜，1 min 后除净残液并放
                                                       1/3
           至肛门的距离），计算 Lee's 指数 = 体质量（g） ×                      入暗匣中曝光，然后依次放入显影液及定影液中至胶片
           1 000/ 体长（cm）。                                      透明，晾干，扫描胶片。以 β-actin 为内参蛋白，采用
           1.5 血清三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、低密度                         Image J 软件分析目标条带的光密度值。
           脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、                     1.9 统计学方法 采用 SPSS 22.0 软件进行统计学分析，
           FFA 水平检测 各组小鼠禁食 6 h 后取尾静脉血 0.2 ml，                  符合正态分布的计量资料以（ ±s）表示，多组间比较
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