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           检者。排除标准：（1）年龄 <18 岁；（2）合并免疫                         毒、支原体、多重感染和未知病原；按照初发感染部位
           系统疾病、恶性肿瘤；（3）近半年使用免疫抑制剂；                            分为肺、血液、腹腔、肝胆系统、泌尿系统、皮肤和软
           （4）临床资料不完整；（5）妊娠妇女。脓毒症组、非                           组织、中枢神经系统和其他。
           脓毒症组和对照组性别、年龄比较，差异无统计学意义                            1.2.3 人外周血单个核细胞的分离 采用 Ficoll 密度梯
           （P>0.05），见表 1。                                      度离心法。向清洁无菌离心管中加入 2 ml 人淋巴细胞
               将复苏后仍需升压药维持平均动脉压≥ 65 mm Hg                      分离液（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司），再
           （1 mm Hg=0.133 kPa）且血乳酸>2 mmol/L定义为休克，              将人外周静脉血（紫色管）1 ml 与经高压灭菌的 0.9%
           将脓毒症患者进一步分为非休克亚组和合并休克亚组。                            氯化钠溶液 1 ml 均匀混合后缓慢加入含有 2 ml 人淋巴
               本研究经武汉大学人民医院医学伦理学委员会批准                          细胞分离液的上层，3 500 r/min 离心 25 min（离心半径
           （批号：WDRY2020-K223），并豁免患者知情同意。                       为 16 cm），离心后可观察到离心管液体由下至上分为
                                                               3 层，取出一二层交界处以单核细胞为主的白色云雾状
                       表 1 三组研究对象一般资料比较                        液体，加入 4 ml 无菌 0.9% 氯化钠溶液中，充分混匀，
           Table 1 Comparison of general information of three groups of participants
                                                               1 500 r/min离心10 min（离心半径为16 cm），重复洗2次，
                                性别〔n（%）〕            年龄
              组别       例数                                      即可得目的细胞。
                                男         女      （ ±s，岁）
             对照组        95   53（55.8）  42（44.2）   57.8±12.7    1.2.4 人外周血单个核细胞总 RNA 提取 采用 Trizol
            非脓毒症组      113   58（51.3）  55（48.7）   60.4±15.7    试剂盒（美国 Invitrogen 公司，15596026）提取细胞总
             脓毒症组      110   64（58.2）  46（41.8）   61.4±14.8    RNA，提取完毕后利用 Nanodrop 2000C 紫外 - 可见分
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            χ （F）值                  1.090           1.877 a    光光度计（美国 Thermo 公司）测定 RNA 浓度及纯度，
              P 值                   0.580           0.155      于 -80 ℃保存备用。
                 a
              注： 为 F 值
                                                               1.2.5 TLR4 mRNA 表达水平检测 使用 Premier 6.0 设
           1.2 研究方法                                            计 TLR4 和 GAPDH 引物，采用 PubMed 对设计的引物
           1.2.1 实验室检查指标 脓毒症组和非脓毒症组患者入                         特异性进行验证，确定最终引物序列，熔解曲线峰单一，
           院确诊并空腹6~8 h后，于次日清晨（对照组于体检当天）                        可见引物特异性良好（图 1），引物序列见表 2。采用
           分别采集静脉血 2 ml 置于一次性真空采血管（已加乙                         Takara 逆转录试剂盒（日本 Takara 公司，RR036A）将
           二胺四乙酸二钾抗凝剂的紫色管）中颠倒混匀；另采集                            细胞总 RNA 逆转录为 cDNA，并采用实时荧光定量 PCR
           静脉血 4~6 ml 室温静置 30 min 后，以转速 3 500 r/min（离          （RT-PCR）试剂盒（日本 Takara 公司，RR901A）对
           心半径 16 cm）离心 5 min，分离血清。在 2 h 内完成以                  TLR4 mRNA 表达水平进行检测，RT 反应条件：37 ℃反
           下指标的检测：红细胞计数（RBC）、白细胞计数（WBC）、                       应 15 min，85 ℃反应 5 s。在 ABI ViiA7 实时荧光 PCR
           中性粒细胞计数（NEU）、血红蛋白（Hb）、血细胞                           仪上设置 PCR 反应程序：（1）95 ℃ 40 s；（2）95 ℃
           比容（HCT）、血小板计数（PLT）采用日本 Sysmex 公                     30 s，64  ℃ 90 s；（4）95  ℃ 15 s，60  ℃ 60 s，95  ℃
           司生产的 XN-9000 全自动血细胞分析仪及其配套试剂                        15 s，循环数为 50，于每次循环末收集荧光信号。
           进行检测；丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨                           1.3 统计学方法 采用 SPSS 25.0 软件对实验数据进行
           基转移酶（AST）、直接胆红素（DBiL）和总胆红素（TBiL）                    统计分析。计量资料采用单样本 Kolmogorov-Smirnov 法
           水平采用西门子公司生产的 AD2400-1 生化分析仪进行                       检验各组数据是否符合正态性，呈正态分布的计量资料
           测定；PCT 采用罗氏诊断公司生产的 cobas8000e801 全                  以（ ±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间进一
           自动化学发光免疫分析仪进行检测。所有指标检测均在                            步两两比较采用 LSD-t 检验；非正态分布采用 M（QR）
           试剂盒说明书规定的时间内完成，且严格遵守实验相关                            表示，多组间比较采用 Kruskal-Wallis H 检验，两两比
           操作规程。                                               较采用 Mann-Whitney U 检验，采用二元 Logistic 回归
           1.2.2 qSOFA、 感 染 病 原、 感 染 部 位  收 集 研 究              分析得到 TLR4 mRNA 与 PCT 联合的回归模型，并绘制
           对象首次实验室检查结果和临床资料，分别计算                               TLR4 mRNA 与 PCT 单独或联合检测诊断脓毒症的受试
           qSOFA。qSOFA 内容：呼吸频率≥ 22 次 /min、收缩压                  者工作特征（ROC）曲线，并计算曲线下面积（AUC）、
                                                                                                        2
           ≤ 100 mm Hg、意识改变计为 1 分，总分 3 分。根据血                   灵敏度、特异度和约登指数。计数资料采用 χ 检验。
           培养（Bac T/Alert 3D 全自动血培养仪，Bruker 基质辅                以 P<0.05 为差异有统计学意义。
           助激光解析飞行时间质谱仪），或细菌基因组 DNA 提                          2 结果
           取试剂盒（博奥生物集团有限公司）和呼吸道病毒检测                            2.1 实验室检查指标比较 三组 RBC、WBC、NEU、
           试剂盒（美国 Diagnostic Hybrids Inc）的检测结果，将               Hb、HCT、PLT、ALT、AST、DBiL 比 较， 差 异 有 统
           感染病原种类分为革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌、病                            计学意义（P<0.05），三组 TBiL 比较，差异无统计学
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