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           20210545），所有患者对本研究知情并签署知情同意书。                       示，两组间比较采用 χ 检验；胃癌组织 PD-L1 mRNA
                                                                               +
           1.2 观察指标                                            相对表达量与 CD 8  TILs 密度的相关性分析采用 Pearson
           1.2.1 临床病理特征 回顾性分析所有患者临床病理特                         相关分析；绘制 Kaplan-Meier 曲线以进行生存分析，采
           征，包括年龄、性别、手术类型、分化程度、浸润深度、                           用 Log-rank 检验；胃癌患者预后的影响因素分析采用
           淋巴结转移情况、脉管侵犯情况、腹膜转移情况等。                             单因素和多因素 Cox 回归分析。以 P<0.05 为差异有统
           1.2.2 预后 通过电话对所有患者进行随访以分析患者                         计学意义。
           预后，随访起始时间为手术结束，终止时间为术后 36                           2 结果
                                                                                                        +
           个月，以患者死亡或失访为终点事件；以随访期间患者                            2.1 胃癌组织 PD-L1 mRNA 相对表达量、CD 8 TILs 密
           死亡为预后不良，随访 36 个月患者仍生存为预后良好。                         度 所有患者胃癌组织平均 PD-L1 mRNA 相对表达量
                                                                                    +
           1.2.3 PD-L1 mRNA 相 对 表 达 量  收 集 所 有 患 者 胃           为 3.1，癌巢内平均 CD 8  TILs 数量为 36 个，最终归为
           癌组织标本并放置于 -80  ℃冰箱中保存。采用实时                          低水平组 73 例和高水平组 52 例，低密度组 55 例和高
           荧光定量反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测所                           密度组 70 例。
                                                                                                        +
           有 患 者 胃 癌 组 织 PD-L1 mRNA 表 达 水 平：（1） 利              2.2 胃癌组织 PD-L1 mRNA 相对表达量、CD 8  TILs 密
           用 TRIZOL 试剂提取总 RNA，并采用紫外分光光度                        度与患者临床病理特征的关系 低水平组与高水平组患
           计检测样品浓度及纯度以确保样本合格；（2）将提                             者年龄、性别、手术类型、分化程度、浸润深度比较，
           取 的 RNA 反 转 录 为 cDNA， 并 根 据 TaKaRa 实 时 荧            差异无统计学意义（P>0.05），淋巴结转移、脉管侵犯、
           光定量 PCR 试剂盒说明书进行操作；（3）以管家基                          腹膜转移情况比较，差异有统计学意义（P<0.05）；低
           因 U6 mRNA 作为内参照（上游引物序列为 5'-GGTT                     密度组与高密度组患者年龄、性别、手术类型、分化程
           CTAGCTATGGTATCGCTTCAAT-3'，下游引物序列为                   度比较，差异无统计学意义（P>0.05），浸润深度、淋
           5'-GCGTCTGGTGATAGTCTGCAGAGT-3'），PD-L1 上             巴结转移、脉管侵犯、腹膜转移情况比较，差异有统计
           游引物序列为 5'-TTGGGAAATGGAGGATAAGAACA-3'，               学意义（P<0.05），见表 1。
           下游引物序列 5'-TGTTGTATGGGGCATTGACT-3'；（4）               2.3 相关性分析 Pearson 相关分析结果显示，胃癌组
                                                                                             +
           设置总反应体系为 20 μl，反应条件：95  ℃预变性                        织 PD-L1 mRNA 相对表达量与 CD 8  TILs 密度呈负相关
           5 min，95 ℃变性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，          （r=-0.412，P<0.001）。
           40 个循环；（5）采用 2       -ΔΔ Ct  法计算 PD-L1 mRNA 相       2.4 生存分析 所有患者随访 2~36 个月，中位随访时
           对表达量，并以 PD-L1 mRNA 相对表达量的平均值为                       间为 36.0 个月；125 例患者中预后不良 37 例，预后良
           临界值，小于该临界值者归为低水平组，等于或大于该                            好 88 例。低水平组与高水平组、低密度组与高密度组
           临界值者归为高水平组。                                         患者 Kaplan-Meier 曲线比较，差异均有统计学意义（χ               2
                    +
           1.2.4 CD 8  TILs 密度 采用免疫组化方法检测所有患                   值分别为 8.189、5.154，P 值分别为 0.004、0.023），
                        +
           者胃癌组织 CD 8 TILs 密度：（1）将胃癌组织石蜡标本                     见图 1、2。
           制备成 4 μm 厚的连续切片并进行梯度脱蜡和水化处                          2.5 单因素和多因素 Cox 回归分析 以临床病理特征
           理，晾干后滴加 3% 过氧化氢溶液，室温放置 10 min；                      为自变量，以预后为因变量进行单因素 Cox 回归分析（变
           （2）切片用磷酸盐（PBS）溶液冲洗后放置于柠檬酸                           量赋值见表 2），结果显示，年龄、浸润深度、脉管侵犯、
                                                                                                        +
           盐缓冲液中浸泡，采用微波加热 20 min 以修复抗原，                        腹膜转移、高水平 PD-L1 mRNA、低密度 CD 8  TILs 是
           自然冷却后用 PBS 溶液冲洗并滴加一抗（兔抗人重组                          胃癌患者预后的影响因素（P<0.05），见表 3；以单因
           anti-CD 8 单克隆抗体，抗体终浓度为 1∶50），4 ℃冰箱                  素 Cox 回归分析结果中差异有统计学意义的指标为自变
           中孵育、过夜；（3）切片再次用 PBS 溶液冲洗后滴加                         量，以预后为因变量进行多因素 Cox 回归分析（变量赋
           抗兔的二抗，室温放置 1 h 后采用二氨基联苯胺（DAB）                       值同上），结果显示，浸润深度为 T 3 ~T 4 、脉管侵犯、
                                                                                                        +
           进行避光显色，采用光学显微镜观察切片，发现组织黄                            腹膜转移、高水平 PD-L1 mRNA、低密度 CD 8  TILs 为
                                                      +
           染时终止显色；（4）在癌巢区随机选取 3 个 CD 8 细胞                      胃癌患者预后不良的独立危险因素（P<0.05），见表 3。
                             +
                                                      +
           丰富区域并计算 CD 8 TILs 数量，并以癌巢内 CD 8  TILs               3 讨论
           数量的平均值作为临界值，小于该临界值者归为低密度                                胃癌细胞中 PD-L1 表达情况可能是抗 PD-L1 免
           组，等于或大于该临界值者归为高密度组。                                 疫治疗的有效生物标志物，检测胃癌组织 PD-L1 表达
           1.3 统计学方法 采用 SPSS 21.0 软件进行数据分析。                    情况具有重要临床意义，但目前关于 PD-L1 表达情况
           本研究计量资料均符合正态分布，以（ ±s）表示，两                           对胃癌患者预后的影响尚存在争议：BÖGER 等                   ［10］ 研
           组间比较采用两独立样本 t 检验；计数资料以相对数表                          究认为肿瘤细胞 PD-L1 阳性的胃癌患者预后良好，但
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