Page 109 - 中国全科医学2022-18
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          （PGC-1α）购自Abcam公司，Anti-核呼吸因子（NRF1）、                  清液，37 ℃孵育 30 min，用酶标记剂冲洗、孵育、显色。
           Anti- 线粒体转录因子 A（mtTFA）购自 GeneTex 公司。                反应结束后，测量各孔的吸光度，并记录。
           1.3 实验仪器 鼠控温解剖台（众实迪创科技发展                            1.5.3 比色法 采用磷钼酸比色法测定线粒体 ATP 含
           有限公司），微量注射泵（圣诺医疗设备有限责任公                             量。将心肌组织裂解，4 ℃下 12 000×g 离心 5 min，收
           司，SN-50F6），多道电生理记录仪（AD instruments，                 集上清液，用分光光度计对样品进行检测。
           DBS-170），Power Lab 数据采集及分析系统（埃德仪                    1.5.4 荧光比色法 采用 JC-1 试剂盒测量线粒体膜电
           器国际贸易公司），精密电子天平（Sartorius 公司），                      位（MMP）。将 1×JC-1 工作液按适当比例加入纯化的
           高速冷冻离心机（Sigma 公司），-80 ℃超低温冰箱（Form                   线粒体中，激发波长为 458 nm，发射波长为 590 nm，
           scientific 公司），酶联免疫检测仪（Thermo 公司）。                  用荧光分光光度计对样品进行检测。
           1.4 动物分组与给药方法 采取随机数字表法将实验                           1.5.5 Western blotting 法 心肌组织样品匀浆后取上清
           动物分为空白组（C 组）、模型组（B 组）、治疗组（T                         液，分离蛋白，测定总蛋白浓度，蛋白样品经十二烷基
           组）、预防组（P 组），每组 10 只。P 组：双侧内关穴                       硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，而后将蛋白转移至聚
           分别注入 0.1 ml 的葛根素注射液。5 min 后开始建立布                    偏二氟乙烯膜上，用一抗、二抗在 37 ℃下分别孵育 1 h，
           比卡因中毒模型（C 组除外），建模方法参照文献［8-                          用 增 强 化 学 发 光 法 获 得 Western blotting 图 像。 采 用
           9］，经 10% 水合三氯乙醛麻醉后，经股静脉 2 min 内                     Image J 软件对靶蛋白条带进行灰度分析，记录 PGC-
           静脉滴注 0.5% 布比卡因 10 mg/kg，Ⅱ导联心电图出现                    1α、NRF1、mtTFA 蛋白水平。
           心律失常（频发室性期前收缩、室性心动过速、QRS 延                          1.6 统计学方法 采用 SPSS 20.0 统计学软件进行数据
           长 20%）表明模型建立成功。将 1 根套管针置于右侧颈                        分析。符合正态分布的计量资料以（ ±s）表示，多组
           动脉以采集血样及监测动脉血压，将另 1 根套管针置于                          间比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间两两比
           左侧股静脉以术中给药，并链接 PowerLab 系统；术中                       较采用 LSD-t 检验。以 P<0.05 为差异有统计学意义。
           持续监测大鼠外周血压及Ⅱ导联心电图。                                  2 结果
               C 组不建模，于双侧内关穴（大鼠前肢内侧，离腕                         2.1 不同处理对大鼠心肌线粒体结构的影响
           关节约 3 mm 尺桡骨缝间）分别注入 0.1 ml 0.9% 氯化                  2.1.1 大鼠心肌线粒体结构电镜观察 C 组大鼠心肌细
           钠溶液。B 组：建模成功后即刻取双侧内关穴分别注入                           胞线粒体数量丰富，颗粒完好呈卵圆形，包膜完整，嵴
           0.1 ml 0.9% 氯化钠溶液。T 组：建模成功后即刻取双侧                    连续；B 组大鼠心肌细胞线粒体数量减少、分布不匀，
           内关穴分别注入 0.1 ml 葛根素注射液。C 组在静脉滴注                      部分线粒体体积变小、形态改变、线粒体膜完整性被破
           0.9% 氯化钠溶液的第 8 分钟，B 组、T 组、P 组分别在                    坏，少量线粒体嵴断裂缺失；T 组大鼠心肌细胞线粒体
           静脉滴注利多卡因的第 8 分钟处死大鼠，提取所有大鼠                          数量略减少，个别线粒体变形、线粒体嵴断裂缺失；P
           左室心肌，分离心肌细胞线粒体。                                     组大鼠心肌细胞线粒体数量较丰富，颗粒完整，部分线
           1.5 指标测定                                            粒体嵴紊乱，无断裂缺失（图 1）。
           1.5.1 透射电镜 实验结束后对大鼠实施安乐死，并                          2.1.2 大鼠心肌线粒体结构损伤情况 四组大鼠
           逆行灌注，提取左室心肌，-80  ℃保存。心肌细胞匀                          Flameng 评分法得分比较，差异有统计学意义（P<0.05）；
           浆，冷冻高速离心，2 000 r/min 离心 10 min（离心半径                 其中 B 组、T 组、P 组大鼠 Flameng 评分法得分高于 C 组，
           5 cm）。取上清液，10 000 r/min 离心 15 min（离心半               差异有统计学意义（P<0.05）；P 组大鼠 Flameng 评分
           径 5 cm），分离心肌细胞线粒体，采用透射电镜观察                          法得分低于 B 组、T 组，差异有统计学意义（P<0.05），
           线粒体的结构。                                             见表 1。
               采用 Flameng 评分法评价线粒体半定量结构，每个                     2.2 不同处理对心肌线粒体功能障碍的影响 四组大
           电镜标本随机选择若干个视野，对每个视野中的线粒体                            鼠 ATPase 活性、ATP 含量、MMP 比较，差异有统计学
           按此法将线粒体的改变分为 5 级，并按等级记分；0 级（0                       意义（P<0.05）。
           分）：正常超微结构的线粒体，颗粒完整；Ⅰ级（1 分）：                             B 组、T 组大鼠 ATPase 活性低于 C 组、P 组，差异
           结构基本正常，部分颗粒丢失；Ⅱ级（2 分）：线粒体                           有统计学意义（P<0.05）。B 组、T 组、P 组大鼠 ATP 含量、
           肿胀，基质透明；Ⅲ级（3 分）：基质透明，线粒体嵴                           MMP 低于 C 组，差异有统计学意义（P<0.05）；T 组、
           断裂或基质中出现絮状凝集；Ⅳ级（4 分）：基质丢失，                          P 组大鼠 ATP 含量、MMP 高于 B 组，差异有统计学意
           线粒体嵴断裂，外膜不完整。                                       义（P<0.05），见表 2。
           1.5.2 ELISA 法 采用 ELISA 法检测心肌细胞 ATPase               2.3 不同处理对心肌线粒体 PGC-1α、NRF1、mtTFA
           活性。组织样品在磷酸盐缓冲液中匀浆后，离心获得上                            蛋白表达的影响 四组大鼠 PGC-1α、NRF1、mtTFA
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