Page 54 - 中国全科医学2022-08
P. 54

http://www.chinagp.net   E-mail:zgqkyx@chinagp.net.cn  ·947·


           制成浓度为 2% 的母液并保存于 -20 ℃冰箱，使用时按                       性分析用于检验组间差异是否大于组内，判断实验分组
           照 0.1 mg/ml 浓度比例混入饮用水中。                             是否存在意义。基于两两样本间的距离值排序获得的秩
           1.3 粪便的无菌收集与处理 喂养 32 周后收集两组小                        （组间的为 Between，组内的为 Within），这样任一两
           鼠粪便：在笼具里面放入干净的滤纸后将小鼠依次放入，                           两样本的比较可以获得 3 个分类的数据，并进行箱线图
           每笼 1 只；用镊子轻轻刺激小鼠下腹和肛门，待小鼠排                          的展示（若两个箱的凹槽互不重叠，则表明两样本的中
           便后立即用冻存管进行收集；将冻存管做好标记后放入                            位数有显著差异）。以 P<0.05 为差异有统计学意义。
           液氮中，5 min 后再将冻存管放入 -80 ℃冰箱中保存。                      2 结果
           最终共收集到 20 个粪便标本，每组 10 个。上述操作均                       2.1 食管组织病理改变 两组小鼠在实验过程中未出
           在灭菌超净台上进行，且所用材料均采用紫外线灭菌                             现死亡，MX 组小鼠均造模成功。DZ 组小鼠食管组织
           处理。                                                 正常，MX 组小鼠食管组织可见鳞状上皮增殖、癌巢形
           1.4 粪便样本检测与数据分析 采用十六烷基三甲基                           成且癌巢内可见角化珠（图 1）。
           溴化铵（CTAB 法）提取粪便标本基因组 DNA，应用                         2.2 肠道菌群测序数据质量评估与 OTU 分析 对两组
           16SV34 区域引物序列 341F：CCTAYGGGRBGCASCAG、               小鼠共 20 例粪便标本进行 16Sr DNA 基因测序，对检
           806R：GGACTACNNGGGTATCTAAT 进行聚合酶链式反                  测的原始数据进行拼接、过滤，得到有效数据，平均
           应（PCR）扩增；将 PCR 产物进行磁珠纯化，并根据                         每样品测得 86 110 条 tags，经过质控平均得到 83 261
           PCR 产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用 2% 琼                         条有效数据，质控有效数据量达 54 489，质控有效率
           脂糖凝胶电泳，然后采用胶回收试剂盒回收目的条带                             达 63.16%。然后基于有效数据进行分析共得到 2 314 个
           以纯化产物；最后使用 TruSeq® DNA PCR-Free Sample              OTU，再用 OTU 序列进行物种注释。结果共有 862 个
           PreParation Kit 建库试剂盒进行文库构建，经 Qubit、                OTU 注释到物种属水平。
           Q-PCR 定量检测构建文库合格后使用 NovaSeq6000 进                       基于 OTU 的 Venn 图中，2 种不同颜色的圆对应两
           行上机测序。                                              组小鼠粪便所含的菌群，重叠部分则为两组共同含有的
               通过对测序序列（Reads）进行拼接、质控和过滤，                       菌群，DZ 组较 MX 组肠道菌群物种丰富程度明显增加，
           以 97% 的一致性将序列聚类成为基于序列间相似度的                          两组小鼠的肠道菌群结构存在差异，见图 2。同时选择
           分类操作单元（operational taxonomic units，OTU），然           DZ 组与 MX 组在门水平上丰度排名前 10 的物种，绘制
           后参照 Silva138 数据库对得到的 OTU 序列进行物种注                    物种相对丰度柱状图（图 3），由图可见，在门水平上
           释，并根据物种注释情况进一步分析 Alpha 多样性、                         两组小鼠样本部分物种丰度存在明显差异，MX 组与 DZ
           Beta 多样性、物种丰度。                                      组相比，拟杆菌门（Bacteroidota）及厚壁菌门（Firmicutes）
               Alpha 多样性分析包括：（1）稀释曲线：是描述                       比例升高，而疣微菌门（Verrucomicrobiota）及变形菌门
           样本多样性的曲线，能够直接反映样本相关测序数据量                            （Proteobacteria）比例降低。
           的合理性，并间接反映样本中物种的丰富程度。（2）                            2.3 两组小鼠肠道菌群 Alpha 多样性分析
           Shannon 指数：为菌群物种 Alpha 多样性分析常用的                     2.3.1 两组小鼠肠道菌群物种多样性曲线 两组小鼠菌
           指数，反映不同样本间物种多样性和均一性的差别，                             群稀释曲线均趋于平坦，则说明目前样本测序数据量渐
           Shannon 指数越大说明菌群多样性越高。                              进合理，即使增加数据量也只会产生少量新的物种，见
               Beta 多样性分析：是对两组样品间的菌群构成情                        图 4。
           况进行比较分析。主坐标分析（PCoA）是常用的 Beta                        2.3.2 两组小鼠肠道菌群 Alpha 多样性指数组间差异分
           多样性分析方法，其基于 Unweighted Unifrac 距离来进                 析 MX 组肠道菌群 Shannon 指数低于 DZ 组，差异有
           行分析，样本间距离越远代表样本间多样性差异越大。                            统计学意义（P<0.05），见表 1。
               物种丰度分析采用 T-test 检验和 LEfSe 分析，其中
           LEfSe 分析是一种软件分析，其能够找到组间有统计学
           差异的生物标志物。
           1.5 食管组织苏木素 - 伊红（HE）染色 完成粪便收
           集后处死两组小鼠，剥取其食管组织并采用 4% 多聚甲
           醛溶液固定，之后进行石蜡包埋、切片、HE 染色，观
           察两组小鼠食管组织病理改变。                                      A                        B
           1.6 统计学方法 采用 SPSS 21.0 统计学软件进行数据                       注：A 为对照组（DZ 组），B 为模型组（MX 组）；HE染色=
           分析。符合正态分布的计量资料以（ ±s）表示，先进                           苏木精 - 伊红染色
                                                                      图 1 两组小鼠食管组织 HE 染色结果（×200）
           行方差齐性分析，之后进行 T-test 检验。Anosim 相似
                                                                 Figure 1 HE staining results of esophagus tissues two groups of mice
   49   50   51   52   53   54   55   56   57   58   59