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·578·  http: //www.chinagp.net   E-mail: zgqkyx@chinagp.net.cn                    February  2023, Vol.26  No.5


           苏碧云天公司），DAB 显色剂（北京中山金桥公司），                          选取每个组织的 3 个显微镜视野并摄片（×400），使
           聚合酶链式反应（PCR）引物（上海生工生物工程有限                           用 Image-Pro Plus 6.0 软件分析计算心肌细胞胶原沉积
           公司），逆转录试剂盒（北京全式金公司），PCR 绿                           面积，并计算心肌组织胶原容积分数（collagen volume
           色荧光染料（上海赛默飞世尔科技公司），DNA marker                       fraction，CVF），CVF= 心肌细胞胶原沉积面积 / 心肌
           II（上海赛默飞世尔科技公司），RNA 提取液（美国                          细胞总面积 ×100%。
           Invitrogen 公司），PCR 核酸扩增仪（日本 Takara 公司），             1.3.5 HE 染色 摘除的各组大鼠眼球于 4% 多聚甲醛
           低温超速离心机（美国 Thermo 公司），奥林巴斯 TH4-                     溶液中固定 24 h 后，石蜡包埋切片，切片厚 5μm。用
           200 倒置显微镜（日本 SANYO 公司）。                             HE 染色，显微镜下观察视网膜结构变化，随机选取每
           1.3 方法                                              个组织的 3 个显微镜视野并摄片（×400），用 Image J
           1.3.1  分 组 7 周 龄 雄 性 WKY 大 鼠 10 只 及 同 源 相           软件测量视网膜各层厚度。
           同周龄 SHR 大鼠 20 只，适应性饲养 1 周以适应环                       1.3.6 免疫组织化学染色 将 WKY 组和 SHR 组干预 0
           境，将 SHR 大鼠随机分为 SHR 组（n=10）和抑制剂                      周的视网膜切片去石蜡后，高压抗原修复 10 min，内源
           （SHR+NPS2143） 组（n=10）；WKY 大 鼠 归 为 WKY               性过氧化物酶抑制剂覆盖切片，室温孵育 10 min，而后
                                                       -1
                                                   -1
           组（n=10）。SHR+NPS2143 组 以 4.5 mg·kg ·d 剂              将视网膜切片与抗 CaSR 的一级大鼠单克隆抗体（1∶50）、
           量腹腔注射 CaSR 抑制剂 NPS2143，WKY 组和 SHR 组                 抗 VEGFA 的一级大鼠单克隆抗体（1∶50）在 4 ℃下孵
           注射等量 0.9% 氯化钠溶液，共注射 16 周至大鼠周龄                       育过夜。次日 PBS 缓冲液冲洗 3 遍后，将切片与辣根过
           24 周。将所有大鼠分组饲养。                                     氧化物酶结合的二抗在 37 ℃下孵育 30 min。冲洗后滴加
           1.3.2 血压测量 分别在持续干预 0 周（8 周龄）和干预                     DAB 溶液显色，紫木苏复染，脱水封片。显微镜下观察
           16 周（24 周龄）时每组选取 5 只大鼠，用 Softron BP-98A             CaSR、VEGFA 免疫阳性产物并摄片（×400）。
           （SOFTRON，日本）大鼠尾部无创血压计测量各组大鼠                         1.3.7 实时荧光定量 PCT（qRT-PCR） 从干预 16 周
           尾部动脉的收缩压（systolic blood pressure，SBP）和舒张压           3 组的视网膜组织中提取总 RNA，NanoDrop 2000 超微
          （diastolic blood pressure，DBP），用公式计算平均动脉压（mean       量分光光度计测量总 RNA 的浓度和纯度。并根据制造
           arterial pressure，MAP），MAP=1/3 SBP+2/3 DBP。室温下，     商的操作手册将 3 mg 总 RNA 逆转录为 cDNA。20 μl
           将大鼠固定在大鼠箱中，尾根放置并固定在血压计的充气                           的荧光定量 PCR 体系包括：2×Quanti Fast SYBR Green
           尾套中，每只大鼠重复测量 3 次，并取平均值。                             PCR Master Mix 10 μl、上、下游引物各 1 μl、模板
           1.3.3 取材 眼球：干预 0 周（8 周龄）时每组选取 5                     cDNA 1 μl、RNase-free water 7 μl。PCR 条 件：94  ℃
           只大鼠，干预 16 周（24 周龄）时每组选取剩余 5 只大                      预变性 30 s；94 ℃变性 5 s，60 ℃退火 34 s，共 38 个
           鼠，称重并根据体质量给予麻醉剂，麻醉后处死大鼠，                            循环；65~95 ℃制作融解曲线。基因的相对表达量与甘
           快速摘出左眼并于 1×PBS 缓冲液中稍加清洗，浸没于                         油醛 -3- 磷酸脱氢酶（GAPDH）（内部参考基因）进
           4% 多聚甲醛溶液中，4 ℃保存用于制作病理切片。摘                          行了归一化。采用 ABI7500 实时 PCR 系统进行操作。
           出右眼于 1×PBS 缓冲液清洗后，置于装有 4% 多聚甲                       CaSR、VEGFA 和 GAPDH 的引物来自上海生工生物工
           醛溶液的培养皿中固定 90 min 后，1×PBS 缓冲液反复                     程有限公司，引物序列如表 1 所示。使用 Image J 软件
           清洗后，移至立式显微镜下。眼科有齿镊夹住视神经断                            对各组 CaSR、VEGFA、GAPDH 灰度值进行分析。
           端，固定眼球，用角膜剪沿角巩膜缘剪下角膜。用镊子                            1.4 统计学分析 采用 SPSS 24.0 软件进行统计分析，
           将晶状体挑出后，用 1×PBS 缓冲液冲洗剩余眼球内壁，                        计量资料以（ ±s）表示，多组间比较采用单因素方差
           去除残留玻璃体后，用镊子将视网膜完整剥离下来后转                            分析，组间两两比较采用 LSD-t 检验，组内比较采用配
           移至 EP 管，标记后 -80 ℃冰箱保存。
               心脏：分别在持续干预 0 周（8 周龄）和干预 16                                        表 1 引物序列
                                                                    Table 1 Primer sequences for GAPDH，VEGFA and CaSR
           周（24 周龄）时将已取眼球的 5 只大鼠用组织剪剪开
                                                                    基因                 引物序列（5'—3'）
           胸骨，露出心脏。迅速取出心脏，分离出左心室，称重
                                                                   GAPDH           F：GACATGCCGCCTGGAGAAAC
           并记录，计算心脏 / 体质量（HW/BW%）和左心室 / 体                                          R：AGCCCAGGATGCCCTTTAGT
           质量（LVW/BW%）。将心肌组织洗净后包裹在锡箔纸中，                            VEGFA           F：CCCTGGCTTTACTGCTGTACC
           储存在 -80 ℃冰箱中，以便日后检测目标蛋白。                                                R：CTTCATGGGCTTTCTGCTCCC
                                                                    CaSR           F：ACGAGCCTCAGAAGAATGCC
           1.3.4 马松（Masson）染色 心肌组织于 4% 多聚甲醛
                                                                                   R：TCCGCATCTGCACACTGTAG
           缓冲液中固定 24 h。梯度酒精脱水后石蜡包埋切片，
                                                                  注：CaSR= 钙 敏 感 受 体，VEGFA= 血 管 内 皮 生 长 因 子 A，
           切片厚 5μm。采用 Masson 染色，显微镜下观察。随机                      GAPDH= 甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶
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