补肾活血方对抗心磷脂抗体阳性复发性流产患者血清和蜕膜中环氧化酶2及前列腺素E2的影响研究

doi:10.12114/j.issn.1007-9572.2020.00.185

摘要/Abstract

摘要： 背景　复发性流产（RSA）是妊娠常见疾病之一，目前的病因学研究表明，抗心磷脂抗体（ACA）（+）与其发病机制密切相关。环氧化酶2（COX-2）具有调节血小板聚集、外周血管收缩等功能，可以催化产生前列腺素E2（PGE2），COX-2及其催化产生的PGE2可能与血液高凝倾向的ACA（+）RSA存在联系，并影响其妊娠结局。目的　明确ACA（+）RSA的COX-2、PGE2异常表达与该疾病的关系，并探索补肾活血方对ACA（+）RSA疾病的治疗作用与分子机制。方法　选取2015年3月—2016年3月在黑龙江中医药大学附属第一医院门诊及住院部治疗的符合纳入标准的ACA（+）RSA流产蜕膜16例，正常流产蜕膜15例，共收集蜕膜样本31例：ACA（+）RSA者蜕膜为试验组1（n=16）、正常人工流产者蜕膜为对照组1（n=15），其中试验组1中1例因流产组织发现染色体异常而排除。选取2015年3月—2016年3月在黑龙江中医药大学附属第一医院门诊及住院部治疗的符合研究标准的要求行保胎治疗ACA（+）RSA患者11例（试验组2），及在黑龙江中医药大学附属第一医院门诊行正常孕检者13例（对照组2），共收集血清样本24例，其中试验组2中1例自然流产、对照组2中3例自动退出，未计入统计数据。采用RT-PCR法检测蜕膜组织中COX-2、PGE2的mRNA；试验组2给予补肾活血方治疗，对照组2不给予干预，于治疗前和治疗后分别留取静脉血。采用ELISA法检测血清COX-2、PGE2水平。结果　对照组1蜕膜组织中COX-2 mRNA、PGE2 mRNA水平均高于试验组1（P<0.05）。治疗前对照组2和试验组2血清P、β-HCG、COX-2、PGE2水平比较，差异有统计学意义（P<0.05）；治疗后对照组2和试验组2血清P、β-HCG、COX-2水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）；治疗后对照组2血清PGE2水平低于试验组2（P<0.05）。试验组2治疗后血清P、β-HCG、COX-2、PGE2 水平均高于治疗前（P<0.05）。结论　ACA（+）RSA患者血清、蜕膜组织中COX-2、PGE2呈低表达，提示COX-2、PGE2可能参与该病的发生。补肾活血方可以通过调节COX-2、PGE2水平而有利于ACA（+）RSA者维持妊娠。

关键词: 流产, 习惯性；抗心磷脂抗体；环氧化酶2；地诺前列酮；补肾活血方

Abstract: Background　Recurrent spontaneous abortion（RSA） is one of the common diseases during pregnancy.Current etiological research shows that ACA（+） is closely related to its pathogenesis.COX-2 plays a role in regulating platelet aggregation and peripheral vasoconstriction，and catalyzing the inducible production of prostaglandin.So COX-2 and COX-2-catalyzed synthesis of PGE2 may be associated with ACA（+） RSA with the trend of blood hypercoagulability and affect pregnancy outcomes.Objective　Clarify the relationship between ACA（+） RSA and the abnormal expression of its COX-2 and PGE2, and explore the therapautical effect and molecular mechanism of method of invigorating the Kidney-nourishment & blood-activation decoction（KBD） to ACA（+） RSA.Methods　All the participants were recruited from First Affiliated Hospital，Heilongjiang University of Chinese Medicine during March 2015 to March 2016，including 16 ACA（+） outpatients and inpatients with a history of RSA and current pregnancy loss undergoing curettage（experimental group 1），11 ACA（+） RSA outpatients and inpatients with a history of RSA undergoing tocolytic therapy due to possible miscarriage symptoms and signs during current pregnancy（experimental group 2），15 outpatients undergoing normal artificial abortion（control group 1），and 13 cases undergoing normal antenatal care（control group 2）.RT-PCR was used to detect the expression levels of COX-2 and PGE2 mRNA in decidua samples of experimental group 1 and control group 1，but 30 cases were finally included（one case in the experimental group 1 was excluded later because chromosome abnormality was found to be the culprit for RSA）.The experimental group 2 received KBD，while control group 2 received no interventions.ELISA was used to measure the expression levels of COX-2 and PGE2 in venous blood samples of experimental group 2 and control group 2 before and after the intervention period.Finally，only 20 cases in these two groups were enrolled because one case in the experimental group 2 was excluded due to later spontaneous abortion，and three cases in control group 2 actively dropped out.Results　（1）The control group 1 showed higher mean expression levels of COX-2 mRNA and PGE2 mRNA in decidual tissues compared with experimental group 1（P<0.05）.（2）At baseline，the control group 2 and experimental group 2 had significant differences in mean serum progesterone，β-HCG，COX-2 and PGE2 levels（P<0.05）.But after receiving KBD，the experimental group 2 showed insignificant different mean levels of serum progesterone，β-HCG，and COX-2（P>0.05），and higher mean serum level of PGE2 compared with the control group 2（P<0.05）.（3）Serum progesterone，β-HCG，COX-2 and PGE2 increased significantly in experimental group 2 after treatment（P<0.05）.Conclusion　Decreased expression levels of COX-2 and PGE2 in serum and decidual tissues of ACA（+） RSA patients indicate that both COX-2 and PGE2 may be involved in the occurrence of the disease.And KBD contributes to the maintenance of pregnancy possibly by regulating COX-2 and PGE2.

Key words: Abortion, habitual；Anticardiolipin antibody；Cyclooxygenase 2；Dinoprostone；Kidney-nourishment &, blood-activation decoction

常卓,李娜,张杨,等. 补肾活血方对抗心磷脂抗体阳性复发性流产患者血清和蜕膜中环氧化酶2及前列腺素E2的影响研究[J]. 中国全科医学, 2020, 23(9): 1158-1163. DOI: 10.12114/j.issn.1007-9572.2020.00.185.
CHANG Zhuo,LI Na,ZHANG Yang, et al. Regulating Effects of Kidney-nourishment & Blood-activation Decoction on COX-2，PGE2 in Serum and Decidua of ACA（+） RSA Patients　[J]. Chinese General Practice, 2020, 23(9): 1158-1163. DOI: 10.12114/j.issn.1007-9572.2020.00.185.

参考文献

［1］乔杰.生殖医学临床诊疗常规［M］．北京：人民军医出版社，2013.
［2］王金英.低分子肝素联合地屈孕酮对复发性流产患者妊娠结局的影响［J］．中国药物经济学，2017，12（7）：50-52.
［3］乐杰.妇产科学［M］．7版.北京：人民卫生出版社，2008:85.
［4］秦诗，高玉平.复发性流产的免疫学因素研究进展［J］．中华生殖与避孕杂志，2018，38（2）：165-169.
QIN S，GAO Y P.Process in immune etiology of recurrent spontaneous abortion［J］．Chin J Reproduction Contracept，2018，38（2）：165-169.
［5］TOTH B，WüRFEL W，BOHLMANN M K，et al．Recurrent miscarriage：diagnostic and therapeutic procedures.Guideline of the DGGG（S1-level，AWMF registry No.?015/050，December 2013）［J］．Geburtshilfe Frauenheilkd，2015，75（11）：1117-1129．DOI:10.1055/s-0035-1558299.
［6］MIYAKIS S，LOCKSHIN M D，ATSUMI T，et al．International consensus statement on an update of the classification criteria for definite antiphospholipid syndrome（APS）［J］．J Thromb Haemost，2006，4（2）：295-306．DOI:10.1111/j.1538-7836.2006.01753.x.
［7］DE JESUS G R，AGMON-LEVIN N，ANDRADE C A，et al．14th international congress on antiphospholipid antibodies task force report on obstetric antiphospholipid syndrome［J］．Autoimmun Rev，2014，13（8）：795-813．DOI:10.1016/j.autrev.2014.02.003.
［8］OPATRNY L，DAVID M，KAHN S R，et al．Association between antiphospholipid antibodies and recurrent fetal loss in women without autoimmune disease：a meta analysis［J］．J Rheumatol，2006，33（11）：2214-2221.
［9］李敏，姚美玉，吴校科.复发性流产与抗心磷脂抗体关系及治疗的探讨［J］．辽宁中医药大学学报，2009，11（5）：52-53．DOI:10.13194/j.jlunivtcm.2009.05.54.lim.141.
LI M，YAO M Y，WU X K.Discuss relationship and treatment between recurrent spontaneous abortion and anticardiolipin antibody［J］．J Liaoning Univ Tradit Chin Med，2009，11（5）：52-53．DOI:10.13194/j.jlunivtcm.2009.05.54.lim.141.
［10］冯晓玲，张伟平.抗心磷脂抗体阳性复发性流产的中西医治疗进展［J］．中医药临床杂志，2014，26（5）：539-540．DOI:10.16448/j.cjtcm.2014.05.036.
［11］马杰彦，林晓凤，张豹.血清孕酮、β-人绒毛膜促性腺激素在早期先兆流产诊断中的应用［J］．中国医药科学，2019，9（11）：93-95.
MA J Y，LIN X F，ZHANG B.Application of serum progesterone and β-Human chorionic gonadotropin in diagnosis of early threatened abortion［J］．China Med Pharm，2019，9（11）：93-95.
［12］肖世金，赵爱民，鲍世民.COX-2及其信号转导通路的表达与自身免疫型复发性流产的关系［J］．上海交通大学学报:医学版，2011，31（7）：895-899.
XIAO S J，ZHAO A M，BAO S M.Relationship between expression of COX-2，its signal transduction pathways and autoimmune-type recurrent miscarriage［J］．J Shanghai Jiaotong Univ：Med Sci，2011，31（7）：895-899.
［13］李旭升，洪丽霞，金庆跃.子宫平滑肌前列腺素E2受体分布与复发性自然流产发病机制的相关性研究［J］．浙江医学，2018，40（7）：676-679，782.
LI X S，HONG L X，JIN Q Y.Relationship between the PGE2 receptor distribution in uterine smooth muscle and the pathogenesis of recurrent spontaneous abortion［J］．Zhejiang Med J，2018，40（7）：676-679，782.
［14］冯晓玲，陈璐，李娜，等．隐丹参酮对ACA、Anti-β2-GP1阳性大鼠抗体水平及TLR4/NF-κB信号通路影响的研究［J］．上海中医药杂志，2015，49（8）：62-65．DOI:10.16305/j.1007-1334.2015.08.022.
FENG X L，CHEN L，LI N，et al．Effects of Cryptotanshinone on the antibody level of SD rats with the positive of Anticardiolipin antibody and anti-β2-GP1and the expression of TLR4 / NF-κB signaling pathway［J］．Shanghai J Tradit Chin Med，2015，49（8）：62-65．DOI:10.16305/j.1007-1334.2015.08.022.
［15］李佳欣，李娜，张杨，等．中西医治疗抗心磷脂抗体阳性复发性流产研究进展［J］．辽宁中医药大学学报，2018，20（11）：125-127．DOI:10.13194/j.issn.1673-842x.2018.11.034.
LI J X，LI N，ZHANG Y，et al．Research progress in the treatment of anticardiolipin antibody positive recurrent abortion in Chinese and Western medicine［J］．J Liaoning Univ Tradit Chin Med，2018，20（11）：125-127．DOI:10.13194/j.issn.1673-842x.2018.11.034.
［16］冯晓玲，李娜，时思毛，等．补肾活血方对抗心磷脂抗体阳性复发性流产的临床研究［J］．中医药信息，2015，32（2）：34-36．DOI:10.19656/j.cnki.1002-2406.2015.02.012.
FENG X L，LI N，SHI S M，et al．Effect of bushen huoxue decoction on recurrent spontaneous abortion with positive anticardiolipin antibody［J］．Inf Tradit Chin Med，2015，32（2）：34-36．DOI:10.19656/j.cnki.1002-2406.2015.02.012.
［17］冯晓玲，常卓，张璇，等．补肾活血方对抗心磷脂抗体（+）复发性流产患者蜕膜及外周血膜联蛋白A2和Toll样受体4的影响研究［J］．中国全科医学，2019，22（6）：701-706.
FENG X L，CHANG Z，ZHANG X，et al．Regulating effects of kidney-nourishment and blood-activation recipe on annexin A2 and toll-like receptor 4 of peripheral blood and decidua in patients with recurrent spontaneous abortion and positive antiphospholipid antibody［J］．Chin Gen Pract，2019，22（6）：701-706.
［18］LOCKSHIN M D.Pregnancy loss and antiphospholipid antibodies［J］．Lupus，1998，7（Suppl 2）：S86-89.
［19］SZODORAY P，BACSKO G Y，LAKOS G，et，al.Combined treatment of a pregnant woman with antiphospholipid syndrome［J］．Orv Hetil，2003，144（49）:2411-2413.
［20］ANTOVIC A，SENNSTR?M M，BREMME K，et al．Obstetric antiphospholipid syndrome［J］．Lupus Sci Med，2018，5（1）:e000197.DOI:10.1136/lupus-2016-000197.
［21］HARRIS E N，SPINNATO J A.Should anticardiolipin tests be performed in otherwise healthy pregnant women?［J］．Am J Obstet Gynecol，1991，165（5 Pt 1）：1272-1277．DOI:10.1016/0002-9378（91）90348-u.
［22］LIN Q D， QIU L H．Pathogenesis，diagnosis，and treatment of recurrent spontaneous abortion with immune type［J］．Front Med China，2010，4（3）:275-279.DOI:10.1007/s11684-010-0101-y.
［23］GEZER S.Antiphospholipid syndrome［J］．Dis Mon，2003，49（12）:696-741．DOI:10.1016/j.disamonth.2003.10.001．
［24］冯晓玲，陈璐，李娜，等．隐丹参酮对ACA、Anti-β2-GP1阳性大鼠抗体水平及TLR4/NF-κB信号通路影响的研究［J］．上海中医药杂志，2015，49（8）：62-65．DOI:10.16305/j.1007-1334.2015.08.022.
FENG X L，CHEN L，LI N，et al．Effects of Cryptotanshinone on the antibody level of SD rats with the positive of Anticardiolipin antibody and anti-β2-GP1and the expression of TLR4 / NF-κB signaling pathway［J］．Shanghai J Tradit Chin Med，2015，49（8）：62-65．DOI:10.16305/j.1007-1334.2015.08.022.
［25］GRACE P M，RAMOS K M，RODGERS K M，et al．Activation of adult rat CNS endothelial cells by opioid-induced toll-like receptor 4（TLR4） signaling induces proinflammatory，biochemical，morphological，and behavioral sequelae［J］．Neuroscience，2014，280：299-317．DOI:10.1016/j.neuroscience.2014.09.020.
［26］MBODJI K，TORRE S，HAAS V，et al．Alanyl-glutamine restores maternal deprivation-induced TLR4 levels in a rat neonatal model［J］．Clin Nutr，2011，30（5）：672-677．DOI:10.1016/j.clnu.2011.04.002.
［27］CREW R C，WADDELL B J，MARK P J.Maternal obesity induced by a ‘cafeteria’ diet in the rat does not increase inflammation in maternal，placental or fetal tissues in late gestation［J］．Placenta，2016，39：33-40．DOI:10.1016/j.placenta.2016.01.002.
［28］KOWALEWSKI M P，FOX B，GRAM A，et al．Prostaglandin E2 functions as a luteotrophic factor in the dog［J］．Reproduction，2013，145（3）：213-226．DOI:10.1530/REP-12-0419.
［29］BLITEK A，WACLAWIK A，KACZMAREK M M，et al．
Expression of cyclooxygenase-1 and -2 in the Porcine endometrium during the oestrous cycle and early pregnancy［J］．Zuchthygiene，2006，41（3）：251-257．DOI:10.1111/j.1439-0531.2006.00646.x.
［30］MENTER D G，SCHILSKY R L，DUBOIS R N.Cyclooxygenase-2 and cancer treatment：understanding the risk should be worth the reward［J］．Clin Cancer Res，2010，16（5）：1384-1390．DOI:10.1158/1078-0432.CCR-09-0788.
［31］SIERRA J C，HOBBS S，CHATURVEDI R，et al．Induction of COX-2 expression by Helicobacter pylori is mediated by activation of epidermal growth factor receptor in gastric epithelial cells［J］．Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2013，305（2）：G196-203．DOI:10.1152/ajpgi.00495.2012.
［32］WANG Y X，REN B，ZHOU X D，et al．Growth and adherence of Staphylococcus aureus were enhanced through the PGE2 produced by the activated COX-2/PGE2 pathway of infected oral epithelial cells［J］．PLoS One，2017，12（5）：e0177166．DOI:10.1371/journal.pone.0177166.
［33］KALINSKI P.Regulation of immune responses by prostaglandin E2［J］．J Immunol，2012，188（1）：21-28．DOI:10.4049/jimmunol.1101029.
［34］HARA S，KAMEI D，SASAKI Y，et al．Prostaglandin E synthases：Understanding their pathophysiological roles through mouse genetic models［J］．Biochimie，2010，92（6）：651-659．DOI:10.1016/j.biochi.2010.02.007.
［35］SAKATA D，YAO C C，NARUMIYA S.Prostaglandin E2，an immunoactivator［J］．J Pharmacol Sci，2010，112（1）：1-5.
［36］KARAVITIS J，HIX L M，SHI Y H，et al．Regulation of COX2 expression in mouse mammary tumor cells controls bone metastasis and PGE2-induction of regulatory T cell migration［J］．PLoS One，2012，7（9）：e46342．DOI:10.1371/journal.pone.0046342.
［37］HOOPER K M，KONG W M，GANEA D.Prostaglandin E2 inhibits Tr1 cell differentiation through suppression of c-Maf［J］．PLoS One，2017，12（6）：e0179184．DOI:10.1371/journal.pone.0179184.
［38］TSUDA S，ZHANG X X，HAMANA H，et al．Clonally expanded decidual effector regulatory T cells increase in late gestation of normal pregnancy，but not in preeclampsia，in humans［J］．Front Immunol，2018，9：1934．DOI:10.3389/fimmu.2018.01934.
［39］高学娟，闫绍颖，段志芳.中西医结合治疗对原因不明复发性流产血清同型半胱氨酸（Hcy）、抗心磷脂抗体（ACA）水平的影响［J］．中华中医药学刊，2018，36（8）：2045-2048．DOI:10.13193/j.issn.1673-7717.2018.08.068.
GAO X J，YAN S Y，DUAN Z F.Combination of traditional Chinese and Western medicine treatment of cysteine，hcy and anticardiolipin antibody（ACA） in serum of patients with unexplained recurrent spontaneous abortion［J］．Chin Arch Tradit Chin Med，2018，36（8）：2045-2048．DOI:10.13193/j.issn.1673-7717.2018.08.068.
［40］许家莹，陆启滨.安子合剂对ACA阳性流产小鼠母胎界面JAK/STAT3信号通路的影响［J］．南京中医药大学学报，2016，32（3）：259-263．DOI:10.14148/j.issn.1672-0482.2016.0259.
XU J Y，LU Q B.Influences of anzi heji on JAK/STAT3 signaling pathway on the maternal-fetal interface of mice suffering ACA positive abortion［J］．J Nanjing Univ Tradit Chin Med，2016，32（3）：259-263．DOI:10.14148/j.issn.1672-0482.2016.0259.
［41］刘红艳.补肾化瘀方治疗复发性流产血栓前状态临床观察［D］．长沙：湖南中医药大学，2017.
LIU H Y.Clinical observation on treatment of recurrent abortion with thrombosis by bushen huayu decoction［D］．Changsha：Hunan University of Chinese Medicine，2017.
［42］谷玥儒.抗心磷脂抗体阳性复发性流产中医证型分布规律及肾虚血瘀型治疗的临床研究［D］．哈尔滨：黑龙江中医药大学，2015.
GU Y R.The clinical research of distribution regularity of traditional Chinese syndrome and kidney deficiency and blood stasis type treatment on recurrent spontaneous abortion patients with anticardiolipin antibody-positive［D］．Harbin：Heilongjiang University of Chinese Medicine，2015.
［43］高佳明，吕明，解微微，等．中医药心脑血管疾病同治的方剂用药规律分析［J］．中国中药杂志，2019,44（1）：193-198.DOI：10.19540/j.cnki.cjcmm.20181101.007．
［44］王国英.补肾活血调经汤治疗多囊卵巢综合征的临床效果［J］．临床医学研究与实践，2018（13）：120-121．DOI:10.19347/j.cnki.2096-1413.201813057.
WANG G Y.Clinical effect of bushen huoxue tiaojing decoction in the treatment of polycystic ovary syndrome［J］．Clin Res Pract，2018（13）：120-121．DOI:10.19347/j.cnki.2096-1413.201813057.
［45］汤伟伟.补肾活血汤影响子宫内膜异位症内膜容受性的机制研究［D］．南京：南京中医药大学，2016.
TANG W W.The mechanism of effect of bushen huoxue tang on endometrial receptivity in endometriosis［D］．Nanjing：Nanjing University of Chinese Medicine，2016.
［46］中华人民共和国卫生部.中药新药治疗先兆流产的临床研究指导原则［S］．2002.
［47］马宝璋.中医妇科学［M］．上海:上海科学技术出版社，2006:141-143.
MA B Z.Gynecology of traditional Chinese medicine［M］．Shanghai：Shanghai Science and Technology Press，2006：141-143.

[1]	王博雅, 何英明, 薛吟霜, 向卉芬. 胚胎种植前遗传学检测助孕妊娠结局的影响因素研究[J]. 中国全科医学, 2023, 26(02): 160-167.
[2]	时娟娟, 崔秀娟, 张丹, 蔺莉. 不明位置妊娠的研究进展[J]. 中国全科医学, 2022, 25(06): 766-770.
[3]	丁珺，吴青，叶惠琴，姚雪萍，吕立清，程贤鹦. 意外妊娠人工流产术后高效避孕措施弃用情况的调查研究[J]. 中国全科医学, 2021, 24(27): 3408-3412.
[4]	焦岩，水旭娟，余彩茶，胡春洪. 超声多模态评分在复发性自然流产患者子宫内膜容受性评价中的应用研究[J]. 中国全科医学, 2020, 23(3): 299-304.
[5]	张清华，潘静，姚丽艳. 复发性流产患者病因构成分析[J]. 中国全科医学, 2020, 23(14): 1760-1764.
[6]	冯晓玲，常卓，张璇，陈璐，王炜，赵小萱，赵颜. 补肾活血方对抗心磷脂抗体（+）复发性流产患者蜕膜及外周血膜联蛋白A2和Toll样受体4的影响研究[J]. 中国全科医学, 2019, 22(6): 701-706.
[7]	缪莹，万沁. 女性流产次数对代谢综合征的影响研究[J]. 中国全科医学, 2019, 22(5): 595-600.
[8]	冯晓玲，常卓，赵小萱，王炜，李雯雯，陈璐. 不明原因复发性流产患者的D型人格与中医证候分布研究[J]. 中国全科医学, 2018, 21(34): 4227-4231.
[9]	罗忠琛，赵娟娟，高玲玲. 意外妊娠人工流产女性长效可逆避孕知识知晓现况及其影响因素研究[J]. 中国全科医学, 2018, 21(3): 306-312.
[10]	邹琳1*，何红华2，庞小艳1，彭彩玲1，韦冰1，许丽华1. 复发性流产患者诊治流程图规范化的临床研究[J]. 中国全科医学, 2018, 21(11): 1336-1340.
[11]	王宝金1*，王新月1，付喜玲1，王蒙蒙1，李霞1，罗真2. 彩色多普勒超声监测子宫螺旋动脉血流与早期先兆流产预后的关系[J]. 中国全科医学, 2017, 20(9): 1132-1135.
[12]	王晓红1，金雪鸿1，陈鹏龙2，方友萍1，范梅花1*，马方3. 妊娠第7周超声检查指标和血清孕酮水平对自发性流产的预测价值研究[J]. 中国全科医学, 2017, 20(13): 1582-1586.
[13]	郭沛沛，刘玉玲，汤福想，杨玉培，李鹏程，王文泽. 2 956例人工流产女性现状分析及人工流产后关爱服务在生殖健康中的作用评价[J]. 中国全科医学, 2016, 19(24): 2982-2985.
[14]	马京梅，潘虹，张慧婧，付杰，于丽，齐雯，杨慧霞. 3376例复发性流产夫妻染色体核型分析[J]. 中国全科医学, 2015, 18(9): 1046-1049.
[15]	李维宏，牟晓玲. 黄体酮保胎治疗对不明原因复发性流产患者外周血辅助性T淋巴细胞17/调节性T淋巴细胞免疫失衡的影响研究[J]. 中国全科医学, 2015, 18(36): 4444-4449.