利用慢病毒载体建立过表达Nfe2l2基因的L929细胞株实验研究

doi:10.12114/j.issn.1007-9572.2018.00.215

摘要/Abstract

摘要： 目的　利用慢病毒载体建立过表达Nfe2l2基因的L929细胞株，为探讨Nfe2l2基因在结缔组织成纤维细胞细胞外基质（ECM）重构中的作用奠定实验基础。方法　2014年12月—2015年5月，通过双酶切将Nfe2l2目的基因连接到GV341载体（Ubi-MCS-3FLAG-SV40-puromycin），经扩增、转化、验证、测序、质粒抽提，将携带目的基因的工具GV341载体质粒及病毒包装辅助质粒Helper1.0、Helper2.0转染293T细胞，完成慢病毒包装及质量检测后获取慢病毒工具载体LV-Nfe2l2，病毒感染L929细胞72 h后筛选稳定表达的细胞株L929/LV-Nfe2l2，采用Real-time qPCR测定Nfe2l2的表达。结果　经比对，构建的LV-Nfe2l2阳性克隆序列与目的基因Nfe2l2相符；L929细胞达到80%感染效率的最佳感染条件为：在ENi.S培养基中进行感染，设定感染复数（MOI）为8~10，感染时间为72 h。Real-time qPCR结果显示，经筛选的L929/LV-Nfe2l2细胞中Nfe2l2基因表达丰度为高（ΔCt值≤12）。结论　本研究成功构建了一种过表达Nfe2l2基因的慢病毒载体；LV-Nfe2l2感染L929细胞后可实现目的基因的高表达，经筛选的L929/LV-Nfe2l2细胞株可用于后续实验研究。

关键词: 转染, 慢病毒属, Nfe2l2, 成纤维细胞, 细胞外基质

Abstract: Objective　To establish a L929 cell line overexpressing Nfe2l2 gene using lentiviral vectors，laying a basis for investigating the role of Nfe2l2 gene in ECM remodeling.Methods　From December 2014 to May 2015，Nfe2l2 gene sequence was ligated into the GV341 vector （Ubi-MCS-3FLAG-SV40-puromycin）via restriction enzyme digestion.After amplification，transformation，verification，sequencing and plasmid extraction，the GV341 vector plasmids carrying the target gene，together with lentiviral packaging plasmids Helper 1.0 and Helper 2.0 were used to co-transfect 293T cells，and the lentiviral vector LV-Nfe2l2 was harvested after packaging and virus concentration test.After being infected by LV-Nfe2l2 for 72 h，the L929 cells were screened for stable L929/LV-Nfe2l2 cell lines.The expression of Nfe2l2 was determined by real-time qPCR.Results Sequence analysis showed that the positive clone of LV-Nfe2l2 was consistent with the target gene Nfe2l2.The optimal conditions for L929 cells to achieve 80% infectious efficiency are as follows：ENi.S medium，MOI of 8-10，infection time of 72 h.Real-time qPCR showed that the abundance of Nfe2l2 gene in L929/ LV-Nfe2l2 cells was high（ΔCt ≤12）．Conclusion In this study，we successfully established a lentiviral vector overexpressing Nfe2l2 gene；target genes with high expression levels could be obtained by LV-Nfe2l2 infected L929 cells；the screened L929/LV-Nfe2l2 cell line can be used in further experimental studies.

Key words: Transfection, Lentivirus, Nfe2l2, Fibroblasts, Extracellular matrix

刘成,汤剑明,李洋,等. 利用慢病毒载体建立过表达Nfe2l2基因的L929细胞株实验研究[J]. 中国全科医学, 2018, 21(30): 3723-3729. DOI: 10.12114/j.issn.1007-9572.2018.00.215.
LIU Cheng,TANG Jianming,LI Yang, et al. Establishment of L929 Cell Line Overexpressing Nfe2l2 Gene Using Lentiviral Vectors：an Experimental Study　[J]. Chinese General Practice, 2018, 21(30): 3723-3729. DOI: 10.12114/j.issn.1007-9572.2018.00.215.

参考文献

［1］SAMPSON N，BERGER P，ZENZMAIER C.Redox signaling as a therapeutic target to inhibit myofibroblast activation in degenerative fibrotic disease［J］．Bio Med Res Int，2014，2014：131737．DOI：10.1155/2014/131737.3729
［2］SAMARAKOON R，OVERSTREET J M，HIGGINS P J.TGF-β signaling in tissue fibrosis：Redox controls，target genes and therapeutic opportunities［J］．Cell Signal，2013，25（1）：264-268．DOI：10.1016/j.cellsig.2012.10.003.3729
［3］HYBERTSON B M，GAO B，BOSE S K，et al．Oxidative stress in health and disease：the therapeutic potential of Nrf2 activation［J］．Mol Aspects Med，2011，32（4/6）：234-246．DOI：10.1016/j.mam.2011.10.006.3729
［4］CHUNG S，YOON H E，KIM S J，et al．Oleanolic acid attenuates renal fibrosis in mice with unilateral ureteral obstruction via facilitating nuclear translocation of Nrf2［J］．Nutr Metab（Lond），2014，11
（1）：2．DOI：10.1186/1743-7075-11-2.3729
［5］HUANG K，HUANG J，XIE X，et al．Sirt1 resists advanced glycation end products-induced expressions of fibronectin and TGF-beta1 by activating the Nrf2/ARE pathway in glomerular mesangial cells［J］．Free Radic Biol Med，2013，65：528-540．DOI：10.1016/j.freeradbiomed.2013.07.029.3729
［6］BOUTTEN A，GOVEN D，ARTAUD-MACARI E，et al．NRF2 targeting：a promising therapeutic strategy in chronic obstructive pulmonary disease［J］．Trends Mol Med，2011，17（7）：363-371．DOI：10.1016/j.molmed.2011.02.006.3729
［7］KOHLER U A，KURINNA S，SCHWITTER D，et al．Activated Nrf2 impairs liver regeneration in mice by activation of genes involved in cell-cycle control and apoptosis［J］．Hepatology，2014，60（2）：670-678．DOI：10.1002/hep.26964.3729
［8］KONSTANTINOPOULOS P A，SPENTZOS D，FOUNTZILAS E，
et al．Keap1 mutations and Nrf2 pathway activation in epithelial ovarian cancer［J］．Cancer Res，2011，71（15）：5081-5089．DOI：10.1158/0008-5472.CAN-10-4668.3729
［9］SPORN M B，LIBY K T.NRF2 and cancer：the good，the bad and the importance of context［J］．Nat Rev Cancer，2012，12（8）：564-571．DOI：10.1038/nrc3278.3729
［10］LIU C，WANG Y，LI B S，et al．Role of transforming growth factor beta1 in the pathogenesis of pelvic organ prolapse：a potential therapeutic target［J］．Int J Mol Med，2017，40（2）：347-356．DOI：10.3892/ijmm.2017.3042.3729
［11］CHEN B，YEH J.Alterations in connective tissue metabolism in stress incontinence and prolapse［J］．J Urol，2011，186（5）：1768-1772．DOI：10.1016/j.juro.2011.06.054.3729
［12］CHEN H，LIN Y，CHEN Y，et al．Stress urinary incontinence following vaginal trauma involves remodeling of urethral connective tissue in female mice［J］．Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2012，163（2）：224-229．DOI：10.1016/j.ejogrb.2012.04.012.3729
［13］KIM E J，CHUNG N，PARK S H，et al．Involvement of oxidative stress and mitochondrial apoptosis in the pathogenesis of pelvic organ prolapse［J］．J Urol，2013，189（2）：588-594．DOI：10.1016/j.juro.2012.09.041.3729
［14］LU D，KASSAB G S.Role of shear stress and stretch in vascular mechanobiology［J］．J R Soc Interface，2011，8（63）：1379-1385．DOI：10.1098/rsif.2011.0177.3729
［15］洪莎莎，丁文娟，吴德斌，等．人子宫旁韧带成纤维细胞力作用下氧化损伤的实验研究［J］．中华临床医师杂志（电子版），2013，7（23）：10775-10779．DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-0785.2013.23.079.3729
HONG S S，DING W J，WU D B，et al．Effects of oxidative damage in human parametrial ligament fibroblasts induced by mechanical stress［J］．Chinese Journal of Clinicians（Electronic Edition），2013，7（23）：10775-10779．DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-0785.2013.23.079.3729
［16］BRYAN H K，OLAYANJU A，GOLDRING C E，et al．The Nrf2 cell defence pathway：Keap1-dependent and -independent mechanisms of regulation［J］．Biochem Pharmacol，2013，85（6）：705-717．DOI：10.1016/j.bcp.2012.11.016.3729
［17］KWAK M K，WAKABAYASHI N，KENSLER T W.Chemoprevention through the Keap1-Nrf2 signaling pathway by phase 2 enzyme inducers［J］．Mutat Res，2004，555（1/2）：133-148．DOI：10.1016/j.mrfmmm.2004.06.041.3729
［18］SUZUKI T，MOTOHASHI H，YAMAMOTO M.Toward clinical application of the Keap1-Nrf2 pathway［J］．Trends Pharmacol Sci，2013，34（6）：340-346．DOI：10.1016/j.tips.2013.04.005.3729
［19］HYBERTSON B M，GAO B，BOSE S K，et al．Oxidative stress in health and disease：the therapeutic potential of Nrf2 activation［J］．Mol Aspects Med，2011，32（4/6）：234-246．DOI：10.1016/j.mam.2011.10.006.3729
［20］ZHANG D D.Mechanistic studies of the Nrf2-keap1 signaling pathway［J］．Drug Metab Rev，2015，38（4）：769-789．DOI：10.1080/03602530600971974.3729
［21］HONG S，LI H，WU D，et al．Oxidative damage to human parametrial ligament fibroblasts induced by mechanical stress［J］．Mol Med Rep，2015，12（4）：5342-5348．DOI：10.3892/mmr.2015.4115.3729
［22］LI B S，GUO W J，HONG L，et al．Role of mechanical strain-activated PI3K/Akt signaling pathway in pelvic organ prolapse［J］．Mol Med Rep，2016，14（1）：243-253．DOI：10.3892/mmr.2015.4115.3729
［23］LIU C，YANG Q，FANG G，et al．Collagen metabolic disorder induced by oxidative stress in human uterosacral ligamentderived fibroblasts：a possible pathophysiological mechanism in pelvic organ prolapse［J］．Mol Med Rep，2016，13（4）：2999-3008．DOI：10.3892/mmr.2016.4919.3729
［24］索磊，杨印祥，栾佐.含人LINGO-1慢病毒干扰载体的构建与鉴定［J］．中国全科医学，2016，19（24）：2962-2966．DOI：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.24.019.3729
SUO L，YANG Y X，LUAN Z.Construction and identification of lentiviral interference vector that including human LINGO-1［J］．Chinese General Practice，2016，19（24）：2962-2966．DOI：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.24.019.3729

[1]	李勇，齐丽翠，张然，杨琦雯，陈树春. 血清成纤维细胞生长因子21水平与糖尿病周围神经病变的相关性研究[J]. 中国全科医学, 2021, 24(33): 4229-4233.
[2]	万红，陈亚琳，崔亚萍，余丹丹，燕树勋. 平突散系列复方对CD40L刺激后人球后成纤维细胞的MMP和TIMP表达的影响[J]. 中国全科医学, 2019, 22(36): 4493-4498.
[3]	董小林，战丽萍，邬刚，李青芸，魏欢，李建辉，李妍平. 重组慢病毒携带酪氨酸羟化酶对大鼠帕金森病模型的干预研究[J]. 中国全科医学, 2018, 21(8): 933-939.
[4]	张楠，姜天，孙莉，代芳，章秋. 2型糖尿病肥胖或超重患者血清成纤维细胞生长因子21水平及其临床价值研究[J]. 中国全科医学, 2018, 21(5): 521-525.
[5]	倪明珠，余锋，王瑶，宋莉莉，刘文灿，徐文，王文静. 皮质下缺血性血管病患者血清基质金属蛋白酶9水平的检测及其临床意义[J]. 中国全科医学, 2018, 21(23): 2823-2826.
[6]	李进领1，李智2，李琳1，张静3*，贾延劼3，安颖1. Let-7b对骨髓基质干细胞诱导分化为神经元的作用研究[J]. 中国全科医学, 2017, 20(33): 4156-4161.
[7]	熊扬眉，丁国华*，陈星华. 骨矿物质代谢与肾性贫血关系的研究进展[J]. 中国全科医学, 2017, 20(26): 3319-3322.
[8]	索磊，杨印祥，栾佐. 含人LINGO-1慢病毒干扰载体的构建与鉴定[J]. 中国全科医学, 2016, 19(24): 2962-2966.
[9]	张源，王丽，张慧，马依彤，杨毅宁，马苗苗，朱晓丽. 建立β3肾上腺素能受体过表达的心肌成纤维细胞模型方法的比较[J]. 中国全科医学, 2016, 19(15): 1774-1780.
[10]	于建超，王勤章，王江平，钱彪，李应龙，王新敏，倪钊，李强. 含人干细胞白血病基因慢病毒载体转染Cajal样间质细胞的效果研究[J]. 中国全科医学, 2016, 19(15): 1796-1802.
[11]	李峰，郑仿，闫家文，赵书晓，黄新，马林枫，郑艺，钟新兰，赵军辉，伍松合. 加味桂枝茯苓颗粒对大鼠前列腺增生组织血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子表达水平的影响[J]. 中国全科医学, 2016, 19(06): 693-697.
[12]	楼正才，陈华英，吴小洪. 不同剂量碱性成纤维细胞生长因子治疗鼓膜创伤性穿孔的疗效比较[J]. 中国全科医学, 2016, 19(06): 706-709.
[13]	林书典，詹锋，武伟，潘楚瑛，张延，刘颖，詹宇威. klotho在慢性肾脏病分期及其并发继发性甲状旁腺功能亢进症中的作用[J]. 中国全科医学, 2016, 19(03): 272-276.
[14]	符天旭，苑姗姗，高莹，屈晨雪，陈澜，惠岩，卢桂芝，高燕明，郭晓蕙. 无代谢综合征组分的体检人群人成纤维细胞生长因子21与促甲状腺激素的关系研究[J]. 中国全科医学, 2015, 18(36): 4422-4427.
[15]	苗小青，王阳，李淑华，艾丽梅，张佩. 重组质粒pcDNA-HA/ΔNp73α转染对人树突状细胞功能的影响[J]. 中国全科医学, 2015, 18(20): 2439-2443.